3. Morfologia cz. I

BADANIA PEŁNEJ KRWI  Ogólne • odczyn opadania krwinek czerwonych • objętość krwi (osocza, krwinek) • lepkość krwi

 Morfologia krwi

Odczyn opadania krwinek czerwonych (OB) Metoda Westergrena – krew cytrynianowa wprowadzana do szklanej rurki z podziałką milimetrową, ustawianej w statywie w pozycji pionowej. Obniżenie się menisku erytrocytów w mm odczytuje się po 1 godzinie. WARTOŚCI REFERENCYJNE: K: <12mm/h M: <8 mm/h

Odczyn opadania krwinek czerwonych (OB) OB jest czułym, ale mało swoistym badaniem stosowanym w diagnostyce zakażeń, zapaleń, chorób układowych i nowotworowych. Najczęstszą przyczyną zwiększenia OB są zmiany w składzie białek osocza – tzw. reakcja ostrej fazy.

 OB!!!

MORFOLOGIA KRWI

Badanie liczby oraz cech morfotycznych komórek krwi: Krwinek czerwonych (erytrocytów)  Krwinek białych (leukocytów)  Płytek krwi

MORFOLOGIA KRWI – ZNACZENIE DIAGNOSTYCZNE • Diagnostyka chorób układu krwiotwórczego • Diagnostyka zakażeń, zapaleń, chorób układowych i nowotworowych

MORFOLOGIA KRWI – FAZA PRZEDANALITYCZANA   





Pobieranie materiału do badań Właściwe zmieszanie krwi Prawidłowy opis próbki Przechowywanie i transport do laboratorium Przygotowanie próbki do analizy

FAZA PRZEDANALITYCZNA OBEJMUJE: 

Błąd związany ze złym przygotowaniem pacjenta do badania (źródło wyników fałszywie dodatnich!!!): a. Przyjmowanie pokarmów i płynów przed badaniem b. Nadmierny wysiłek fizyczny przed badaniem

WPŁYW STYLU ŻYCIA NA WYNIK BADANIA: Ćwiczenie ruchowe i sport

Palenie papierosów

Picie alkoholu

- dochodzi do ↑WBC - wytężony wysiłek może być przyczyną hemolizy

-Długotrwałe

palenie tytoniu (obecność CO) może prowadzić do ↑HCT, ↑WBC, ↑RBC oraz ↑MCV np. 1 paczka/dzień przez 1rok średni wzrost ok. 1000 kom/μL, 2 paczki/dzień – 2000 kom/ μL - Przewlekle pijący mają utrwaloną ↑MCV (wynik toksycznego działania etanolu na erytropoezę i na poziom kwasu foliowego)

ZMIENNOŚĆ FIZJOLOGICZNA 

Wiek badanego



Płeć pacjenta



Rytm dobowy



Wpływ wysokości nad poziomem morza na wartość wyniku morfologii krwi

RYTM DOBOWY: 

WBC są wyższe wieczorem



Wzrost WBC jest prawdopodobnie związany ze wzrostem limfocytów T (szczególnie CD4+), których poziom wzrasta w godzinach południowych

WYSOKOŚĆ (m/npm): 







Powyżej 1400 m/npm wartość HGB i HCT wzrasta aż o 8%. Warunki hipoksji uruchamiają erytropoezę (wzrost EPO) Wyższe wartości u wspinaczy górskich, pracowników kolejek górskich Średnio 3 tyg. trwa adaptacja do warunków prowadząca najpierw do wzrostu i kolejne 3 tyg. do normalizacji

JAKI ANTYKOAGULANT WYBRAĆ?

Rekomendowanym przez International Council for Standarization in Haematology oraz National Comittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) antykoagulantem do pomiaru elementów morfotycznych krwi obwodowej jest

K2EDTA 1,5±0,25 g/dl

MORFOLOGIA KRWI – ZAGADNIENIA PRZEDANALITYCZNE  

 

Pełna krew żylna pobrana na EDTA Dezynfekcja miejsca pobrania materiału alkoholem (70% izopropylowym lub etylowym) i dokładne osuszenie pola Opis probówki w obecności pacjenta Użycie igieł o optymalnej średnicy (systemy próżniowe)

MORFOLOGIA KRWI – ZAGADNIENIA PRZEDANALITYCZNE cd.    

Założenie stazy Nakłucie naczynia Szybkie zwolnienie stazy Aspiracja prawidłowej objętości krwi  Dokładne wymieszanie próbki  Przygotowanie krwi do transportu  Krew może być przechowywana w temperaturze +4°C do 24 godz.

WŁAŚCIWE MIESZANIE PRÓBKI (po pobraniu 8-10 cykli) (przed analizą 20 cykli)

MORFOLOGIA KRWI METODYKA • Metody manualne (mikroskopowe)

• Analizatory automatyczne

MORFOLOGIA KRWI • • • • • • • • • •

Hematokryt Stężenie hemoglobiny Liczba erytrocytów Wskaźniki czerwonokrwinkowe Erytrogram Retykulocyty Liczba leukocytów Obraz odsetkowy leukocytów Liczba płytek krwi Wskaźniki płytkowe

HEMATOKRYT

FRAKCJA OBJĘTOŚCIOWA ERYTROCYTÓW W PEŁNEJ KRWI.

Warości referencyjne:

K: 37 – 47% M: 40 – 54%

STĘŻENIE HEMOGLOBINY Metody spektrofotometryczne (cyjanomethemoglobinowa, bezcyjankowe).

Hb

K3Fe(CN)6; KCN

Cyjanomet-Hb

Pomiar spektrofotometryczny ( = 540 nm)

STĘŻENIE HEMOGLOBINYWARTOŚCI REFERENCYJNE • • • • • • •

K

Noworodek: 13.5 - 24.0 g/dl <1 m.ż.: 10.0 - 20.0 g/dl 1-2 m.ż.: 10.0 - 18.0 g/dl 2-6 m.ż.: 9.5 - 14.0 g/dl 0.5-2 r.ż.: 10.5 - 13.5 g/dl 2-6 r.ż.: 11.5 - 13.5 g/dl 6-12 r.ż.: 11.5 - 15.5 g/dl

• 12-18 r.ż.: 12.0 - 16.0 g/dl • >18 r.ż: 12.1 - 15.1 g/dl

M

• 12-18 r.ż.: 13.0 - 16.0 g/dl • >18 r.ż.: 13.6 - 17.7 g/dl

LICZBA ERYTROCYTÓW Erytrocyty są zliczane przy użyciu mikroskopu i komór (Bürkera, Neubauera) po rozcieńczeniu krwi 1:200 lub przez liczniki automatyczne.

KOMORA (HEMOCYTOMETR) Grube szkiełko podstawowe z dwiema powierzchniami do zliczania krwinek, z naniesioną siatką, znajdującymi się na głębokości 0,1 mm, przykrywanymi szkiełkiem nakrywkowym. Krwinki w rozcieńczonej próbce są zliczane w objętości określanej przez powierzchnię wyznaczaną liniami siatki oraz głębokość komory.

KOMORA (HEMOCYTOMETR)

LICZBA ERYTROCYTÓW – WARTOŚCI REFERENCYJNE     K   M  

<1 m.ż.: 3.6 - 6.6 x 106 /l 1-6 m.ż.: 2.7 - 5.4 x 106 /l 0.5 - 6 r.ż.: 3.7 - 5.3 x 106 /l 6-12 r.ż.: 4.0 - 5.2 x 106 /l 12-18 r.ż.: 4.1 - 5.1 x 106 /l >18 r.ż.: 3.8 - 5.2 x 106 /l 12-18 r.ż.: 4.5 - 5.3 x 106 /l >18 r.ż.: 4.4 - 5.9 x 106 /l

WSKAŹNIKI CZERWONOKRWINKOWE Określają wielkość (objętość) i wysycenie hemoglobiną erytrocytów. Są wyliczane na podstawie wyników oznaczeń hematokrytu, liczby erytrocytów i stężenia hemoglobiny oraz analizy rozkładu objętości erytrocytów

WSKAŹNIKI CZERWONOKRWINKOWE • Średnia waga hemoglobiny (SWH, MCH) • Średnie stężenie hemoglobiny (SSH, MCHC) • Średnia objętość krwinki (SOK, MCV) • Rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW)

Średnia waga hemoglobiny (SWH, MCH) SWH [pg] = HGB [g/l] / RBC [x1012/l]

Wartości referencyjne:

27 – 31 pg

Średnie stężenie hemoglobiny (SSH, MCHC) SSH [g/dl] = HGB [g/dl] / HCT [l/l]

Wartości referencyjne:

32 – 36 g/dl

Średnia objętość krwinki (SOK, MCV)

MCV [fl] = HCT [l/l] x 1000 / RBC [x1012/l]

Wartości referencyjne:

82 – 92 fl

Rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW – Red Cell Volume Distribution Width) Współczynnik zmienności (lub odchylenie standardowe) rozkładu objętości erytrocytów – wskaźnik anizocytozy.

Wartości referencyjne:

(RDW-CV): 11 – 15%    RDW   

Rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW – Red Cell Volume Distribution Width)

MCV

WSKAŹNIKI CZERWONOKRWINKOWE – ZNACZENIE DIAGNOSTYCZNE

(Skotnicki, Nowak 2002)

RDW

MCV

Rodzaj niedokrwistości

Przyczyna

MCV 

jednorodna mikrocytowa

choroby przewlekłe (ACD)

MCV N

jednorodna normocytowa

przewlekłe choroby wątroby, przewlekła białaczka szpikowa, sferocytoza wrodzona

MCV 

jednorodna makrocytowa

niedokrwistość aplastyczna, MDS

RDW  MCV 

niejednorodna mikrocytowa

niedobór żelaza, fragmentacja erytrocytów, talasemia major

MCV N

niejednorodna normocytowa

Wczesne stadium iedoboru Fe i kw. foliowego, osteomielofibroza

MCV 

niejednorodna makrocytowa

niedobór wit. B12, kw. foliowego

RDW N

ERYTROGRAM Opis morfologii krwinek czerwonych na podstawie mikroskopowej oceny rozmazu krwi barwionego metodą Pappenheima

ERYTROGRAM • Wielkość krwinek (mikrocytoza, makrocytoza, anizocytoza) • Kształt krwinek (poikilocytoza, sferocytoza, owalocytoza i in.) • Wybarwienie krwinek (hipochromia, anizochromia) • Wtręty wewnątrzkrwinkowe

PRAWIDŁOWY ERYTROCYT

Erytroblast

ELIPTOCYTY

KRWINKI SIERPOWATE

ANIZOCYTOZA, HIPOCHROMIA

Ciałka Howella – Jolly’ego

Poz. jądra

Ciałka Pappenheimera

Fe

ERYTROGRAM A WSKAŹNIKI CZERWONOKRWINKOWE

Mikrocytoza

MCV 

Makrocytoza

MCV 

Anizocytoza

RDW 

Hipochromia

MCH, MCHC 

RETYKULOCYTY Młode formy erytrocytów zawierające w cytoplazmie pozostałości siateczki endoplazmatycznej. Oznaczane przez mikroskopową ocenę rozmazu krwi po barwieniu przyżyciowym lub metodami cytometrii przepływowej.

RETYKULOCYTY

RETYKULOCYTY – WARTOŚCI REFERENCYJNE  Odsetek liczby erytrocytów: Dzieci i dorośli: 0,5 – 1,5% Noworodki: 2 – 6%  Liczba bezwzględna (x103/l) Dorośli: 30 – 100 Noworodki: 65 – 230 L. Thomas, 1999

SKORYGOWANA LICZBA RETYKULOCYTÓW KOREKTA WZGLĘDNEJ LICZBY RETYKULOCYTÓW WG HEMATOKRYTU JEST WYMAGANA PRZY MAŁEJ ILOŚCI DOJRZAŁYCH ERYTROCYTÓW:

SLR = LR x HCT/45 Skorygowane liczby retykulocytów określa się tylko w niedokrwistościach. Im większa jest niedokrwistość i większe wytwarzanie erytropoetyny, tym bardziej niedojrzałe retykulocyty przechodzą do krwi i tym dłużej w niej dojrzewają.

Wskaźnik wytwarzania retykulocytów (RPI) RPI = SLR / skorygowany czas dojrzewnia HCT

45 35 25 15

1.0

1.5 2.0 2.5

Skorygowany czas dojrzewania (dni)

RPI - INTERPRETACJA • RPI 3.0 – prawidłowa erytropoeza

• RPI <2.0 – nieprawidłowa erytropoeza

PRZYCZYNY ZMIAN LICZBY RETYKULOCYTÓW •  LR – niedokrwistość pokrwotoczna, nedokrwistość hemolityczna, leczenie (żelazo, wit. B12, kw. foliowy) niedokrwistości niedoborowych. •  LR – niedobór żelaza, wit. B12, kw. foliowego, ACD, niedobór EPO, niedokrwistość hipoplastyczna, przewlekłe białaczki, mielofibroza, MDS.

Algorytm oceny układu czerwonokrwinkowego Hgb < 11 mg%, WBC i PLT (+ rozmaz) prawidłowe MCV 82 – 100 fl

< 82 fl Niedobór żelaza (szerokie RDW) Przewlekły stan zapalny Thalassemia (wąskie RDW) Zatrucie aluminium

> 100 fl Choroby wątroby Alkoholizm Niedobór witaminy B12 i kwasu foliowego MDS Niedoczynność tarczycy

Retikulocyty

Niskie Anemia Aplastyczna Anemia B-D Choroby rozrostowe szpiku Przewlekła n. nerek

Wysokie Hemoliza Krwawienie

ANALIZA SUBPOPULACJI RETYKULOCYTÓW NIEDOJRZAŁE RETYKULOCYTY (DUŻA ZAWARTOŚĆ RNA)

FRAKCJA NIEDOJRZAŁYCH RETYKULOCYTÓW (IRF) = WSKAŹNIK DOJRZAŁOŚCI RETYKULOCYTÓW (RMI) Zawartość niedojrzałych retykulocytów (o największej i średniej fluorescencji lub rozproszeniu światła) w całkowitej populacji tych komórek. Wartości referencyjne:

0.1-0.3 (10-30%)

Liczba krwinek białych Zliczane metodami automatycznymi lub manualnymi (hemocytometry, mikroskop). Przed liczeniem leukocytów w komorze trzeba doprowadzić do hemolizy erytrocytów. Wartości referencyjne:

4000 – 10000/l

Obraz odsetkowy krwinek białych

• Leukocyty (WBC)

4000 - 10000/l

• Neutrofile (NEU)

60 - 70%

• • • •

20 - 45% 4 – 8% 2 - 4% 0 - 1%

– Młode – Pałeczkowate – Segmentowane

Limfocyty Monocyty Eozynofile (EOS) Bazofile (BASO)

0 - 1% 3 - 6% 58 - 66%

Obraz odsetkowy krinek białych • Metody manualne – mikroskopowe badanie rozmazu krwi barwionego metodą Pappenheima. • Metoda manualna jest metodą referencyjną dla zautomatyzowanych technik badania obrazu odsetkowego, szczególnie w obecności młodych form. • Metody automatyczne

mieloblast

promielocyt

mielocyt

metamielocyt

SZPIK

pałeczka

segment

KREW

BARIERA SZPIKOWA

SEGMENT

MIELOBLAST HIATUS LEUCAEMICUS

Barwiony rozmaz krwi: neutrofile

Neutrofile – ziarnistości toksyczne

Zasadochłonne ziarnistości w cytoplaźmie granulocytów obojętnochłonnych (stają się podobne do bazofilów). Występują w ciężkich zakażeniach, oparzeniach, nowotworach złośliwych.

Neutrofile – ciałka Dohle’a

Niebieskie wtręty w cytoplaźmie neutrofilów, zawierające m.in. ziarna glikogenu. Występują w zakażeniach, oparzeniach, chorobach mieloproliferacyjnych i ciąży.

Neutrofile – anomalia Pelgera-Hueta

Jądra dojrzałych granulocytów obojętnochłonnych i kwasochłonnych są pałeczkowate lub dwupłatowe. Czynność krwinek jest prawidłowa.

Barwiony rozmaz krwi: eozynofil

Barwiony rozmaz krwi: bazofil

Barwiony rozmaz krwi: monocyt

Barwiony rozmaz krwi

Automatyczne badanie obrazu odsetkowego leukocytów KRYTERIA IDENTYFIKACJI KOMÓREK W LICZENIU AUTOMATYCZNYM Rozmiar (objętość) komórki

Stosunek wielkości jądra do cytoplazmy Kształt komórki i jądra komórkowego Rozmiar i liczba ziarnistości

Wybarwianie się składników komórki Selektywna liza za pomocą detergentów

ZASADY DETEKCJI Potencjometria przepływowa: Wielkość krwinek wykrywana jest na podstawie zmian oporności prądu a gęstość wnętrza komórek na podstawie zmian natężenia fal radiowych, rejestrowanych w postaci odpowiednich impulsów. W oparciu o wielkość impulsów powstaje dwuwymiarowy rozkład (skatergram) wielkości i gęstości komórek krwi.

Cytometria przepływowa z użyciem lasera: 1. Przechodzące i odbite światło rozproszone, dając kolejno informacje o rozmiarach komórek oraz ich wnętrzu, np. rozmiarach jądra 2. Boczne światło fluorescencyjne, wiązka światła padającego na material fluoryzujący np. barwione komórki powoduje emisję światła. Pomiar intensywności światła fluorescencyjnego pozwala dostarczyć informacji o stopniu barwienia komórek.

Automatyczne badanie obrazu odsetkowego leukocytów • OGRANICZENIA • Interferencje erytrocytów lub konglomeratów płytek. • Brak identyfikacji leukocytów nietypowych, młodych form. Odsetek atypowych leukocytów powyżej 2-3% jest wskazaniem do mikroskopowej oceny rozmazu krwi.

Przyczyny zmian obrazu odsetkowego leukocytów •  NEU – ostre zakażenia bakteryjne, białaczki szpikowe, gorączka reumatyczna, RZS, dna moczanowa, urazy •  NEU – niedokrwistość aplastyczna, chemioterapia, radioterapia, zakażenia wirusowe (grypa)

Przyczyny zmian obrazu odsetkowego leukocytów (2) •  LYMPH – przewlekłe zakażenia bakteryjne, WZW, szpiczak mnogi, białaczka limfatyczna, zakażenia wirusowe (mononukleoza zakaźna, świnka, odra i in.). •  LYMPH – chemioterapia, radioterapia, zakażenie HIV, białaczki, posocznica.

Przyczyny zmian obrazu odsetkowego leukocytów (3) •  MONO – przewlekłe stany zapalne, zakażenia pasożytnicze, gruźlica, zakażenia wirusowe (mononukleoza zakaźna, świnka, odra i in.). •  EOS – reakcje alergiczne, zakażenia pasożytnicze, ziarnica złośliwa

PŁYTKI KRWI - LICZBA • Najmniejsze elementy morfotyczne krwi. Metody manualne (hemocytometry, mikroskop) zostały obecnie zastąpione metodami automatycznymi.

BADANIA PŁYTEK KRWI WYKONYWANE PRZEZ ANALIZATOR HEMATOLOGICZNY

• Liczba płytek krwi • Średnia objętość płytki (MPV) • Współczynnik zmienności rozkładu objętości płytek (PDW) – miara zróżnicowania wielkości płytek • Hematokryt płytkowy (PCT)

BADANIE PŁYTEK KRWI WYKONYWANE PRZEZ ANALIZATOR HEMATOLOGICZNY

Wartości referencyjne:

Liczba: 180000 – 400000 /l MPV: 6 – 8 fl

OGRANICZENIA K2EDTA DLA PLT 

Szczególnie niekorzystny wpływ na wartość oznaczenia MPV- zmiana kształtu PLT (czas!!!)



Zjawisko pseudotrombocytopenii we krwi pobranej na K2EDTA (aglutynacja PLT z autoprzeciwciałami IgG po odsłonięciu kompleksu błonowego glikoproteiny IIb/IIIa). Dotyczy ok. 0,1% -0,2% populacji.

OGRANICZENIA K2EDTA DLA PLT(2) 





Pseudotrombocytopenia stanowi ok. 7,5 do 15,3% wszystkich przypadków trombocytopenii Pseudotrombocytopenia z K2EDTA nasila się z czasem od pobrania krwi oraz w temp. 4-20°C. W temp. 37 °C w krwi cytrynianowej reaktywnych jest 17% autoprzeciwciał (głównie klasy IgM)

OGRANICZENIA K2EDTA DLA PLT(3) 

W wyniku pseudotrombocytopenii dochodzi do zafałszowanego obniżenia liczby ↓PLT z jednoczesnym fałszywym wzrostem ↑WBC



Satelityzm płytek (zlepy PLT+NEU) przyczyna

pseudotromocytopenii oraz pseudoleukopenii

PROPONOWANE DZIAŁANIA NAPRAWCZE: 

Błąd związany z występowaniem pseudotrombocytopenii z jednoczesnym zafałszowanym wzrostem WBC po pobraniu krwi na K2EDTA należy rozwiązywać poprzez oznaczanie ponowne po pobraniu na cytrynian lub heparynę

Liczba PLT w 3 różnych antykoagulantach (pseudotrombocytopenia)