4 a metodologia

Podstawowe techniki biologii molekularnej

Hybrydyzajca molekularna- łączenie się dwóch komplementarnych nici DNA lub RNA ze sobą (DNA/DNA, RNA/DNA, RNA/RNA), możliwe dzięki zasadzie komplementarności,

niekoniecznie pełnej

wykorzystywana w technice Southerna, FISH i in.

FISH (fluorescent in situ hybrydyzation, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) polega na zastosowaniu znakowanych fluorescencyjnie sond molekularnych (zwykle oligonukletydów DNA) komplementarnych do określonych genów lub fragmentów genomu występujących

w pojedynczej kopii lub specyficznych dla określonych regionów chromosomów (telomery, centromery, określone chromosomy)

Trisomia 21

Zastosowanie: Określenie pochodzenia chromosomów markerowych Określenie pochodzenia insercji Stwierdzenie obecności delecji submikroskopowych (PraderWilli; Angelman, Miller-Dieker i in.) lub translokacji

SEKWENCJONOWANIE

5’ 3’

32p-TAGCTGACTC ATCGACTGAGTCAAGAGCTATTGGGCTTAA... Polimeraza DNA +dATP, dGTP, dCTP, dTTP, +ddGTP w niskim stężeniu

5’ 3’

32p-TAGCTGACTCAG ATCGACTGAGTCAAGAGCTATTGGGCTTAA... + 32p-TAGCTGACTCAGTTCTCG ATCGACTGAGTCAAGAGCTATTGGGCTTAA... + 32p-TAGCTGACTCAGTTCTCGATAACCCG ATCGACTGAGTCAAGAGCTATTGGGCTTAA...

5’ 3’ 5’ 3’

ojciec

matka

dzieci

Elektroforeza białek

PCR - reverse transcriptase PCR

multiplex PCR nested PCR quantitative PCR

real-time PCR NASBA - Nucleic Acid Sequence-Based Amplification SDA - Strand Displacement Amplification

mikromacierze Dwa różne cDNA (z dwóch różnych organizmów, tkanek…) są różnie zabarwione A na płytce znajduje się do 40.000 fragmentów cDNA = sond

Zielone + czerwone = żółte

Skanowanie i analiza wyników

A) B) C) D)

transfekcja komórki nowotworowej siRNA formowanie kompleksu RISC w komórce odnalezienie komplementarnej sekwencji mRNA degradacja mRNA