Biochemia - proseminarium_1 2012

Komórka bakteryjna

1

Komórka zwierzęca

2

Komórka roślinna

1865– Grzegorz Mendel ustala prawa genetyki, jeszcze tak jej nie nazywając. 1926 – Hermann Müller wywołuje mutacje muszek naświetlając je promieniowaniem rentgenowskim (NN w 1946 r.). 1944 – Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarthy wykazują, że przenosząc DNA z bakterii do bakterii przenosi się jednocześnie cechy genetyczne. To doświadczenie uznaje się za pierwszy dowód, iż nośnikiem genów jest DNA. Alexander Todd definiuje strukturę chemiczną i przestrzenną składników DNA (NN w 1957 r.). 1950 – Ervin Chargaff wylicza, że liczba składników w DNA pozostaje w stałej proporcji: A=T oraz G=C. 1953 – James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins i Rosalind Franklin odkrywają molekularną strukturę kwasu deoksyrybonukleinowego oraz jego rolę w przechowaniu i przekazywaniu informacji genetycznej (NN dla trzech pierwszych w 1962 r.). Arthur Kornberg, Severo Ochoa rozwijają badania enzymologiczne (polimerazy kwasów nukleinowych) związane z kwasami nukleinowymi (NN w 1959 r.). 1965 – Robert Holley, Gobind Khorana, Marshall Nirenberg odkrywają kod genetyczny (NN w 1968 r.). 1973 – David Baltimore, Howard Temin, Renato Dulbecco badając retrowirusy odkrywają zjawisko odwrotnej transkrypcji (NN w 1975 r.). 1977 – Walter Gilbert, Frederick Sanger opracowują dwie różne metody sekwencjonowania DNA (NN w 1980 r.). Phillip Sharp, Richard Roberts odkrywają zjawisko podzielonych genów i dojrzewania RNA (NN w 1993 r.). 1983 – Kary B. Mullis wynajduje metodę PCR – powielania DNA polimerazą DNA, a Michael Smith opracowuje metody sterowanej mutagenezy (NN w 1993 r.). 2000 – Rozkwit metod (NMR i spektroskopii rezonansu jądrowego) jednoczesnej analizy wielu setek białek, fundamenty proteomiki (NN w 2002 r. – Kurt Wutrich, John Fenn, Koichi Tanaka). 2001 – Zakończenie sekwencjonowania ludzkiego genomu.

3

Funkcja biologiczna białek •

Kataliza enzymatyczna (oksydoreduktazy, transferazy, hydrolazy, liazy, izomerazy, syntetazy)

•

Transport i magazynowanie (hemoglobina, mioglobina, ferrytyna)

•

Ruch uporządkowany (białka mięsni)

•

Funkcje mechaniczno-strukturalne (kolagen, białko fibrylarlne)

•

Ochrona immunologiczna (białka o dużej swoistości w przeciwciałach)

•

Wytwarzanie i przekazywanie impulsów nerwowych (rodopsyna, receptory nerwowe)

•

Kontrola wzrostu i różnicowania (białka represorowe, insulina, polimerazy)

4

5

6

7

Struktura białka

8

Helisa α

Harmonijka β

9

Struktura czwartorzędowa białek

Struktura Mioglobiny

W mioglobinie występuje 8 α helis (oznaczonych od A-H). Większość aminokwasów hydrofobowych stanowi wnętrze Mioglobiny, natomiast aminokwasy polarne ulokowane są przeważnie na powierzchni białka. 75% α helisa

prawoskrętna

Wnętrze jest niepolarne Zaburzenia wywołuje prolina

10

Struktura Mioglobiny W obrębie hydrofobowego wnętrza mioglobiny znajduje połączona niekowalencyjnie prostetyczna grupa hemowa, biorąca udział w przenoszeniu tlenu.

Apoproteina

hemowa grupa prostetyczna

11

Struktura Hemoglobiny HbA- hemoglobina dorosłego człowieka, składa się z: 2 łańcuchów α 2 łańcuchów β Masa = 64,45 kDa

Łańcuch α = 141 aminokwasów Łańcuch β = 146 aminokwasów δ, γ, ε Każdy z łańcuchów tworzy 8 helis α i zawiera prostetyczną grupę hemową, dlatego hemoglobina może wiązać cztery cząsteczki O2

A=α2β2

2%

A2=α2δ2

α2 ε 2 F=αγ2

12

Jon Fe2+ w hemoglobinie tworzy 6 możliwych wiązań: •4 atomami pierścienia protoporfiryny • 1 resztą proksymalnej histydyny His F8 ( 8 pozycja w helisie F) • ostatnie wiązanie służy do wiązania cząsteczki tlenu

13

Procesowi utleniania hemoglobiny towarzyszą zmiany geometrii wiązania kationu żelaza i zmiany konformacyjne w obrębie łańcuchów polipeptydowych.

Allosteryczność hemoglobiny •

Hemoglobina jest białkiem allosterycznym.

•

Wiązanie cząsteczki O2 do jednej podjednostki hemoglobiny jest uzależnione od jej oddziaływania z pozostałymi podjednostkami.

•

Wiązanie cząsteczki O2 do jednej podjednostki wywołuje takie zmiany konformacyjne, że maja one wpływ na konformację sąsiednich jednostek zwiększając ich powinowactwo względem O2 i tym samym ułatwiając wiązanie kolejnych cząsteczek O2.

•

Wiązanie O2 z hemoglobiną jest kooperatwnne.

•

Wiązanie O2 z pojedynczym łańcuchem mioglobiny jest niekooperatywne.

14

15

Krzywe dysocjacji tlenu dla hemoglobiny i mioglobiny

1 Dla hemoglobiny krzywa ma kształt sigmoidalny, co odzwierciedla wiązanie kooperatywne O2 Dla mioglobiny krzywa dysocjacji ma kształt hiperboli, co odzwierciedla wiązanie niekooperatwne O2.

Z analizy krzywych dysocjacji tlenu wynika, że dla danej wartości cząstkowego ciśnienia tlenu stopień wysycenia tlenem jest wyższy dla mioglobiny niż dla hemoglobiny

16

Efekt Bohra - molekularne wyjaśnienie Hemoglobina utlenowana zmienia swoją konformację na skutek: •Działania anhydrazy węglanowej zwiększającej zakwaszenie przy zwiększonej ilości CO2 •Protonacji reszt His 146 łańcucha β •Tworzenia ujemnie naładowanych karbaminianów z pierwszorzędowymi grupami aminowymi łańcucha polipeptydowego. anhydraza węglanowa

HCO3- +

CO2 + H2O

H+

CO2 łańcuch polipeptydowy

H łańcuch polipeptydowy

NH2

N C

-

łańcuch polipeptydowy

H N N

H

+

O

łańcuch polipeptydowy

+

H

+

O H N +

N

H

17

Efekt Bohra - molekularne wyjaśnienie

Przyłącznie CO2 i H+ do hemoglobiny wywołuje duże zmiany konformacyjne, które zmniejszą powinowactwo hemoglobiny do tlenu (następuje jego oddysocjowanie w tkankach) i tworzy się hemoglobina nieutlenowana, która transportuje CO2 do płuc. Tam mechanizm zmian konformacyjnych zachodni w druga stronę i hemoglobina oddysocjowuje CO2 i wiąże O2.

Rola 2,3-difosfoglicerynianu (DPG) w regulacji allosterycznej

•

Związek ten wiąże się w małej centralnej szczelinie hemoglobiny utworzonej przez 4 podjednostki hemoglobiny. Ułatwia on oddysocjowanie O2 przez hemoglobinę, zmniejszając powinowactwo tego białka względem O2.

•

DPG stabilizuje czwartorzędową strukturę hemoglobiny nieutlenowanej, na skutek silnych oddziaływań z dodatnio naładowanymi resztami aminokwasów podjednostek β.

•

H+, CO2 i DPG są regulatorami allosterycznymi, stabilizując konformację hemoglobiny nieutlenowanej, ułatwiają w ten sposób uwalnianie O2 w tkankach. Efekty ich działań podlegają sumowaniu, pomimo iż każda z tych cząsteczek oddziałuje na inne miejsce hemoglobiny

18

19

U płodu występuje hemoglobina HbF, składa się ona z dwóch łańcuchów α i dwóch łańcuchów γ (α2 γ2). Hemoglobina ta wykazuje większe powinowactwo do O2 od hemoglobiny dorosłego człowieka (HbA α2 β2), co pozwala przenosić tlen z krwi matki do krwi płodu przez łożysko.

HbF wiąże słabiej DPG niż HbA.

Pod koniec życia płodowego organizm uruchamia syntezę łańcucha β,a zaprzestaje syntezy łańcucha γ.

Animacja 1

20

Kolagen - główne białko tkanki łącznej. Posiada ono bardzo wysoką odporność na rozciąganie i stanowi główny składnik ścięgien. Jest odpowiedzialny za elastyczność skóry. Ubytek kolagenu ze skóry powoduje powstawanie zmarszczek, w trakcie jej starzenia. Kolagen wypełnia także rogówkę oka, gdzie występuje w formie krystalicznej. Kolagen jest powszechnie stosowany w kosmetykach, zwłaszcza w kremach i maściach przeciwzmarszczkowych. Stosuje się go też jako wypełniacz w chirurgii kosmetycznej - np. do wypełniania ust.

21

Kolagen ma nietypowy skład aminokwasów. Zawiera duże ilości glicyny i proliny oraz dwa aminokwasy nie pochodzące bezpośrednio z translacji w rybosomach hydroksyprolinę i hydroksylizynę Proces formowania kolagenu wymaga konieczności występowania stałego stężenia witaminy C w organizmie, gdyż zablokowanie syntezy kolagenu skutkuje chorobą zwaną szkorbutem, polegającą na uszkodzeniach skóry, błon śluzowych i wypadaniu zębów. Łańcuchy kolagenu składają się z regularnych triad aminokwasów:

Gly-X-Y, gdzie X i Y to inne aminokwasy. Na ogół X to prolina, zaś Y to hydroksyprolina.

22

Enzymy

Katalizator obniża energię aktywacji reakcji chemicznej, przez co zwiększa jej szybkość.

OKSYDOREDUKTAZY - należą tutaj enzymy katalizujące reakcje oksydo-redukcyjne, przemiany związane z przeniesieniem elektronów i tlenu; przenoszą protony i elektrony z substratu na koenzymy lub odwrotnie, czasem na tlen. Reduktazy - katalizują przeniesienie protonów i elektronów. Oksydazy - to enzymy, które aktywują tlen cząsteczkowy. Oksygenazy i hydroksylazy - katalizują przyłączanie tlenu do związku organicznego z przeniesieniem protonów i elektronów, a peroksydazy działają utleniająco na związki organiczne w obecności H2O2. TRANSFERAZY - enzymy te katalizują reakcje przenoszenia grup pomiędzy poszczególnymi związkami i to zwykle z udziałem specjalnych koenzymów. Przedstawiciele: aminotransferazy, glikozylotransferazy,kinazy. HYDROLAZY - enzymy tej klasy katalizują reakcje hydrolizy, czyli rozkładu wiązań z udziałem cząsteczki wody. Ważniejsze gr. to estrazy, glikozydazy, peptydazy, amidazy. LIAZY - enzymy, które odwracalnie lub nieodwracalnie katalizują odłączenie grup od substratu, bez udziału wody. IZOMERAZY - tu należą enzymy katalizujące takie reakcje izomeryzacji jak: racemizacja, epimeryzacja, izomeryzacja. LIGAZY - enzymy katalizujące wytwarzanie wiązań między 2- cząsteczkami co jest związane z reakcją rozpadu bogatego w energię związku makroergicznego np. z udziałem ATP. W przemianach katabolicznych cukrów biorą udział enzymy katalizujące rozkład wiązań glikozydowych.

23

Typy enzymów

24

Reakcja enzymatyczna zachodzi w centrum aktywnym

Model klucza i zamka

Emil Fischer 1890

Centrum aktywne - obejmuje małą część cząsteczki - jest układem przestrzennym - jest specyficzne, zależy od ułożenia atomów - wiązanie S z E odbywa się przez słabe siły

Model wymuszonego dopasowywania

Daniel E. Koshland 1958

25

Katalizatorami w układach biologicznych są enzymy i prawie wszystkie z nich są białkami. Enzymy są bardzo specyficzne i charakteryzują sie duża siła katalityczną. Zwiększają one szybkość reakcji przynajmniej 106 razy. Enzymy nie zmieniają równowagi reakcji, lecz służą jako katalizatory zmniejszające energie aktywacji reakcji chemicznych. Pierwszym etapem katalizy jest tworzenie kompleksu enzym-substrat. Substraty są związane z enzymem w miejscu aktywnym umieszczonym w szczelinie, w której po związaniu substratu, woda jest w zasadzie nieobecna. Specyficzność oddziaływań enzymu z substratem zdeterminowana jest głównie wiązaniami wodorowymi, które są ukierunkowane, oraz kształtem miejsca aktywnego, które nie dopuszcza cząsteczek o niedostatecznie komplementarnym kształcie. Rozpoznanie substratów przez enzymy jest procesem dynamicznym, któremu towarzysza konformacyjne zmiany w miejscach aktywnych.

26

Model Michaelisa-Menten Model Michaelisa-Menten tłumaczy właściwości kinetyczne pewnych enzymów. W modelu tym enzym (E) łączy sie z substratem (S) tworząc kompleks enzym-substrat (ES), który może sie przekształcać, tworząc produkt (P) lub dysocjować z powrotem do E i S.

Szybkość V tworzenia produktu jest określona przez równanie Michaelisa-Menten

Vmax- szybkość reakcji w warunkach całkowitego wysycenia enzymu substratem, KM stała Michaelisa - stężenie substratu, w którym szybkość osiąga połowę wartości maksymalnej. KM jest równe takiemu stężeniu substratu, dla którego szybkość reakcji osiąga polowe swojej wartości maksymalnej. Szybkość maksymalna, Vmax, jest równa iloczynowi k3 i całkowitego stężenia enzymu. Stała kinetyczna k3, nazywana liczba obrotów enzymu, jest liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkt reakcji w jednostce czasu przez pojedyncze miejsce katalityczne w warunkach pełnego wysycenia enzymu substratem, Dla większości enzymów liczba obrotów leży w granicach od 1 do 104 na sekundę.

8. Właściwości kinetyczne wielu E opisuje model Michaelisa - Menten

27

Szybkość maksymalną reakcji V i stałą Michaelisa KM wyznacza się przy użyciu metod przekształcających równanie Michaelisa-Menten z zależności hiperbolicznej w prostoliniową. Najczęściej stosowana jest metoda Lineweavera-Burke'a, gdzie zastosowano odwrotność równania podstawowego

Enzymy mogą ulęgać inhibicji przez specyficzne małe cząsteczki lub jony.

W inhibicji nieodwracalnej inhibitor łączy sie kowalencyjnie z enzymem lub wiąże z nim tak silnie, ze jego dysocjacja jest bardzo powolna. Inhibicję odwracalną charakteryzuje szybko ustalający sie stan równowagi między enzymem a inhibitorem.

Inhibitor kompetycyjny (konkurencyjny, współzawodniczący) zapobiega wiązaniu sie substratu z miejscem aktywnym. Zmniejsza on szybkość reakcji przez zmniejszenie liczby cząsteczek enzymu związanych z substratem. W inhibicji niekompetycyjnej (niekonkurencyjnej ,niewspółzawodniczącej ) inhibitor zmniejsza liczbę obrotów enzymu.

Inhibicje kompetycyjna można odróżnić od niekompetycyjnej stwierdzając, czy zwiększenie stężenia substratu znosi efekt inhibicji.

28

9. Enzymy mogą ulegać procesom inhibicji (głównie kontroli biologicznej) nieodwracalna i odwracalna

Inaktywacja chymotrypsyny diizopropylofluorofosforanem (DIPF)

Inaktywacja amidem kwasu jodooctowego

Odwracalna: Inhibicja konkurencyjna

Cechą charakterystyczna inhibicji kompetycyjnej jest możliwość jej cofnięcia przez dostatecznie duże stężenie substratu. Substrat i inhibitor współzawodniczą o to samo miejsce. Przy odpowiednio dużym stężeniu substratu praktycznie wszystkie miejsca są obsadzone substratem i enzym jest w pełni aktywny.

29

Inhibicja konkurencyjna

Inhibicja konkurencyjna

Inhibitor konkurencyjny wykazuje strukturalne podobieństwo do normalnego substratu danego enzymu, przez co współzawodniczy w wiązaniu się z miejscem aktywnym enzymu. Inhibitor kompetencyjny wiąże się z miejscem aktywnym enzymu odwracalnie.

30

Praktyczne wykorzystanie inhibicji konkurencyjnej

Antybiotyki peptydowe zawierają D-aminokwasy i aminokwasy niebiałkowe, które hamują syntezę białek w intensywnie rozwijających się bakteriach

Leki antybakteryjne typu sulfamidów są strukturalnie podobne do kwasu p-aminobenzoesowego, który jest składnikiem koenzymu F

Odwracalna: Inhibicja niekonkurencyjna

Inhibicji niekompetycyjnej nie da sie przezwyciężyć przez zwiększenie stężenia substratu.

Inhibitor niekonkurencyjny wiąże się odwracalnie w innym miejscu enzymu niż jego miejsce aktywne i wywołuje taką zmianę przestrzenną struktury enzymu, która zmniejsza jego aktywność katalityczną (inhibicja allosteryczna).

31

Inhibicja niekonkurencyjna

Enzymów allosterycznych nie obowiązuje kinetyka Michaelisa-Menten

Inhibitor allosteryczny przesuwa równowagę R
T w kierunku T, aktywator allosteryczny natomisat - w kierunku R. Zarazem allosteryczny aktywator zwiększa zdolność wiązania substratu do enzymu, natomiast allosteryczny inhibitor zdolność te zmniejsza.

32

Allosteryczna kontrola enzymów

Izoenzymy - homologiczne enzymy w obrębie danego organizmu, które katalizują tę samą reakcję, ale różnią się nieznacznie strukturą, wartościami Km i Vmax oraz właściwościami regulacyjnymi. Izoenzymy często ulegają ekspresji w różnych tkankach lub organellach lub w różnych stadiach rozwojowych. Są kodowane przez geny zajmujące różne loci, które zwykle powstają w wyniku duplikacji genu i dywergencji. Izoenzymy można często odróżnić od siebe na podstawie właściwości biochemicznych, takich jak ruchliwość elektroforetyczna. Przykładem izoenzymu może być dehydrogenaza mleczanowa (LDH), enzym uczestniczący w beztlenowym metabolizmie glukozy i syntezie glukozy.

33

Koenzymy - małocząsteczkowe, niebiałkowe związki organiczne decydujące o aktywności katalitycznej pewnych enzymów. Biorą udział w reakcjach przez oddawanie lub przyłączanie pewnych reagentów (atomów, grup atomów lub elektronów). Pozostają luźno związane z właściwym enzymem. Jako koenzymy funkcjonują w większości witaminy lub jony połączone odwracalnie z apoenzymem.

Cząsteczka NAD jest dinukleotydem składającym się z adenozyno-5'-monofosforanu i nukleotydu nikotynoamidowego połączonych ze sobą wiązaniem bezwodnikowym. Cząsteczka NAD+ wiąże jeden proton i dwa elektrony. Miejscem ich działania jest amid kwasu nikotynowego. Drugi proton pozostaje w środowisku reakcji. Zredukowany NAD+ (NADH) przekazuje proton i elektrony na mitochondrialny łańcuch oddechowy, gdzie poprzez wiele ogniw pośrednich są one przekazywane na tlen, tworząc H2O. Procesowi temu towarzyszy powstawanie energii magazynowanej w postaci ATP.

Cząsteczka NADP+ różni się do NAD+ obecnością reszty fosforanowej przy węglu 2' rybozy nukleotydu adeninowego.

NADP+ jest także akceptorem protonu i elektronów w reakcjach utleniania, lecz powstający NADPH nie przekazuje protonu i elektronów na łańcuch oddechowy. Są one zużytkowywane w różnych reakcjach redukcji, głównie w przebiegu biosyntezy kwasów tłuszczowych i cholesterolu. W organizmach samożywnych NADP powstaje w początkowym etapie fotosyntezy i jest zużywany później w cyklu Calvina.

34

Mononukleotyd flawinowy, FMN, koenzym uczestniczący w reakcjach redoks jako przenośnik elektronów, współdziałający z oksydazami i dehydrogenazami, zawierający ryboflawinę (witaminę B2); występuje w formie utlenionej (FMN) i zredukowanej (FMNH2). FMN, (ryboflawino-5'-fosforan) - w organizmie wytwarzany z ryboflawiny (witamina B2), stanowi grupę prostetyczną niektórych oksydaz, np. oksydazy L-aminokwasowej, zwykle mocno (ale nie kowalencyjnie) związana z apoenzymem. Uczestniczy w wielu reakcjach red-oks organizmów żywych, np. w reakcji: FMN + ATP → FAD + PPi Dinukleotyd flawinoadeninowy, FAD - organiczny związek chemiczny, złożony z mononukleotydu flawinowego (FMN) (pochodnej ryboflawiny) i kwasu adenozynomonofosforowego (AMP), koenzym oksydoreduktaz, pełniący funkcję przenośnika elektronów i protonów. Przenosi dwa protony i dwa elektrony, w efekcie czego utleniona forma FAD przechodzi odwracalnie w formę zredukowaną FADH2.

Flawoproteiny, enzymy flawinowe, enzymy z klasy oksydoreduktaz; zawierają jako grupę prostetyczną mononukleotyd flawinowy (FMN) lub dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD); biorą udział w procesach oddychania komórkowego.

35

36

37

Aktywacja enzymów Aktywacja zymogenu przez hydrolizę specyficznych wiązań peptydowych.

Aktywacja przez fosforylację reszty seryny (odwracalne modyfikacje kowalencyjne).

Sprzężenie zwrotne: inhibicja pierwszego enzymu szlaku metabolicznego przez odwracalne wiązanie produktu końcowego

38

Proenzymy PROENZYMY, (zymogeny) - enzymy w naturalnej, nieaktywnej postaci, które w wyniku działania rozmaitych czynników przechodzą w postać aktywną; proces aktywacji proenzymów polega na hydrolitycznym rozerwaniu wiązań peptydowych fragmentu łańcucha peptydowego; najważniejsze p. to pepsynogen, trypsynogen, chymotrypsynogen.

Schemat wydzielania zymogenu przez komórki pęcherzykowate trzustki

39

Chymotrypsyna

Aktywacja chymotrypsynogenu przez rozszczepienie proteolityczne

Chymotrypsyna

Centralna rola trypsyny w aktywowaniu enzymów trzustkowych

40

Chymotrypsyna

•Chymotrypsyna rozszczepia wiązanie peptydowe (lub estrowe) po karboksylowej stronie dużych reszt aminokwasów aromatycznych i hydrofobowych (Trp, Phe, Tyr, Met).

Chymotrypsyna

41

Chymotrypsyna

Chymotrypsyna należy do rodziny enzymów zwanych proteazami serynowymi, ponieważ w miejscu aktywnym mają serynę. Do tej samej rodzinny należą także trypsyna i elastaza.

Chymotrypsyna, trypsyna i elastaza – specyficzność substratowa enzymów trawiennych

•Trypsyna rozszczepia peptydy po karboksylowej stronie dodatnio naładowanych reszt (Arg lub Lys). •Chymotrypsyna rozszczepia peptydy po karboksylowej stronie dużych reszt aminokwasów aromatycznych i hydrofobowych (Trp, Phe,Tyr, Met). •Elastaza rozszczepia peptydy po karboksylowej stronie reszt o krótkich, nienaładowanych łańcuchach bocznych (Gly, Ala).

42

Co przedstawiają poniższe wykresy?

43