kwasy nukleinowe 3

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA Rozpuszczalność kwasów nukleinowych
Wykonanie ćwiczenia:
Część pierwsza: do 0,5 ml 0,1 % roztworów RNA i DNA dodać kroplami 1M HCl. Następnie dodawać kroplami NaOH. Część druga: do 1 ml 0,1 % roztworów RNA i DNA dodać 2 ml 96% etanolu. W obu przypadkach zanotować obserwacje.
Obserwacje:
- RNA + HCl – powstaje zmętnienie, które znika po dodaniu NaOH
- DNA + HCl – powstaje zmętnienie, które znika po dodaniu NaOH
- RNA + etanol i DNA + etanol – w obu przypadkach pojawia się biały delikatny osad
Wnioski:
Kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, słabo w wodzie, kwasach i alkoholach. W pierwszej części doświadczenia po dodaniu kwasu roztwory w probówkach zrobiły się mętne, co jest oznaką wytrącania się kwasów nukleinowych, gdyż w kwaśnym środowisku maleje ich rozpuszczalność. Dodanie zasady, czyli zobojętnienie środowiska podniosło rozpuszczalność kwasów nukleinowych, dzięki czemu zmętnienie w obu probówkach zanikło. W drugiej części doświadczenia po dodaniu alkoholu do probówek z kwasami nukleinowymi pojawił się osad, co jest spowodowane zmniejszeniem się rozpuszczalności tychże kwasów w obecności alkoholi. Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych
Wykonanie ćwiczenia:
2,5 ml 1 % roztworów DNA i RNA zmieszać z 2,5 ml 10 % kwasy siarkowego (VI). Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę.
Wnioski:
Po dodaniu kwasu siarkowego do probówek z kwasami nukleinowymi oraz po inkubacji we wrzącej łaźni wodnej zaobserwowaliśmy brak jakiegokolwiek zmętnienia. Jest to spowodowane rozpadem kwasów nukleinowych na wolne zasady purynowe i nukleotydy pirymidynowe. Dlatego też, pomimo kwaśnego środowiska, nie doszło do zmętnienia roztworów. Wykrywanie pentoz – reakcja orcynolowa
Wykonanie ćwiczenia:
Do każdej z 6 probówek zawierających po 1 ml jednej z określonych substancji (hydrolizaty i 0,1 % roztwory DNA i RNA oraz 1 % roztwory rybozy i deoksyrybozy) dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po wyjęciu z łaźni i ostudzeniu dodać po 5 ml wody destylowanej (do rozcieńczenia barwy, niekoniecznie) i określić barwę roztworu.
Obserwacje:
- dla hydrolizatu RNA – barwa zielona roztworu
- dla hydrolizatu DNA – barwa zielona roztworu
- dla 0,1 % roztworu RNA – barwa zielona roztworu
- dla 0,1 % roztworu DNA – barwa zielona roztworu
- dla 1 % roztworu rybozy – barwa zielona roztworu
- dla 1 % roztworu deoksyrybozy – barwa zielona roztworu
Wnioski:
Pentozy wolne i związane w nukleozydach, ogrzewane w środowisku kwaśnym przechodzą w furfural, który z orcyną i jonami Fe3+ dają trwały kompleks o barwie zielonej. Reakcja zaszła we wszystkich trzech próbach potwierdzając obecność w nich pentoz. Wykrywanie pentoz – reakcja Dischego
Wykonanie ćwiczenia:
Do każdej z 6 probówek zawierających po 1 ml jednej z określonych substancji (hydrolizaty i 0,1 % roztwory DNA i RNA oraz 1 % roztwory rybozy i deoksyrybozy) dodać po 2 ml odczynnika difenyloaminowego i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.
Obserwacje:
- dla hydrolizatu RNA – bezbarwny, klarowny roztwór
- dla hydrolizatu DNA – barwa niebieska roztworu
- dla 0,1 % roztworu RNA – bezbarwny, klarowny roztwór
- dla 0,1 % roztworu DNA – barwa niebieska roztworu
- dla 1 % roztworu rybozy – bezbarwny, klarowny roztwór
- dla 1 % roztworu deoksyrybozy – barwa niebieska roztworu
Wnioski:
W środowisku kwaśnym deoksyryboza przechodzi w aldehyd hydroksylewulionowy, który następnie kondensuje z difenyloaminą, tworząc niebieski produkt. Jest to reakcja charakterystyczna na wykrycie deoksyrybozy, czyli cukru występującego w DNA i jego hydrolizacie. Wykrywanie kwasu fosforowego
Wykonanie ćwiczenia:
Do 0,5 ml hydrolizatu DNA lub RNA (przeprowadziłem obie reakcje) dodać 3 krople roztworu amoniaku. Następnie dodać 0,5 ml stężonego roztworu HNO3 i 2 ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówki ogrzać do wrzenia.
Obserwacje:
- dla hydrolizatu DNA – żółty osad, żółta barwa roztworu
- dla hydrolizatu RNA – żółty osad, żółta barwa roztworu, zmętnienie
Wnioski:
Powstanie żółtego osadu świadczy o wytrąceniu się nierozpuszczalnego fosfomolibdenianu amonowego. Potwierdza to obecność kwasu ortofosforowego w próbach. Wykrywanie puryn
Wykonanie ćwiczenia:
Do 1 ml hydrolizatu DNA lub RNA (przeprowadziłem obie reakcje) dodać 6 kropli stężonego roztworu amoniaku i 3 ml amoniakalnego roztworu azotanu srebra.
Obserwacje:
- dla hydrolizatu DNA – powstał kłaczkowaty biały osad
- dla hydrolizatu RNA – powstał kłaczkowaty biały osad
Wnioski:
Sole zasad purynowych z metalami ciężkimi (np. Ag) w środowisku kwaśnym wytrącają się w postaci krystalicznej. Powstanie osadu w obu probówkach świadczy o obecności puryn w próbach. Powstałym związkiem (osadem) jest sól srebrowa puryny (adeniny lub guaniny). Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną
Wykonanie ćwiczenia:
Do 5 g kostki bulionowej (bulion cielęcy Knorr) dodać około 75 ml wody destylowanej, gotować we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, a następnie po wystudzeniu przesączyć do kolby miarowej o pojemności 100 ml przez gazę młyńską i uzupełnić do kreski wodą destylowaną. Po lekkim wystudzeniu przesączyć roztwór przez sączek z bibuły i rozcieńczyć 0,1 M HCl 20-krotnie (0,5 ml roztworu na 19,5 ml kwasu). Dla tak przygotowanych próbek zmierzyć wartości absorbancji przy trzech długościach fali: 249, 262 i 290 nm. Te wartości pozwalają odnotować różnice w zabarwieniu poszczególnych roztworów.
Część praktyczna doświadczenia:
- dla adeniny (roztwór standardowy): ΔE(262-290) = 0,900
- dla guaniny (roztwór standardowy): ΔE(262-290) = 0,457
Tabela 1 – Różnice ekstynkcji dla roztworów badanych
Kostka
Adenina
ΔE(262-290)
Guanina
ΔE(249-290)
Bulion grzybowy Knorr
0,248
0,175
Bulion grzybowy Winiary
0,311
0,258
Rosół drobiowy Winiary
0,143
0,144
Bulion na włoszczyźnie
0,118
0,115
Rosół z kury Kucharek
0,235
0,241
Bulion cielęcy Knorr
0,322
0,311
Bulion wołowy Knorr
0,081
0,046
Rosół z kury Knorr
0,146
0,071
Przykład obliczeń zawartości zasad azotowych w kostkach spożywczych wyróżnionych w tabeli kolorem czerwonym:
Dla adeniny:
Dla guaniny:
Tabela 2 – Zawartość zasad azotowych w poszczególnych kostkach spożywczych
Kostka
Adenina
[mg/g kostki]
Guanina
[mg/g kostki]
Bulion grzybowy Knorr
1,102
1,532
Bulion grzybowy Winiary
1,380
2,256
Rosół drobiowy Winiary
0,636
1,26
Bulion na włoszczyźnie
0,524
1,001
Rosół z kury Kucharek
1,044
2,109
Bulion cielęcy Knorr
1,431
2,722
Bulion wołowy Knorr
0,36
0,404
Rosół z kury Knorr
0,649
0,621
Wnioski:
Najmniejszą zawartość puryn (około 0,5 – 1 mg/g kostki) wykazują kostki pochodzenia drobiowego i roślinnego, największą (około 1,3 – 2,7 mg/g kostki) - kostki grzybowe i cielęce. Bardzo niska zawartość zasad w bulionie wołowym Knorr (0,36 – 0,404 mg/g kostki) wynika z błędów popełnionych podczas wykonywania doświadczenia przez grupę, która opracowywała ten podpunkt. Podsumowując – doświadczenie to pozwoliło potwierdzić obecność zasad purynowych w kostkach spożywczych. Oznaczanie zawartości DNA metodą difenyloaminową
Wykonanie ćwiczenia:
Ćwiczenie składa się z dwóch etapów: ekstrakcji DNA i jego oznaczenia.
Ekstrakcja kwasów nukleinowych:
Około 5 g wątroby wieprzowej lub około 2,5 g mleczu ze śledzia zhomogenizować z 50 ml zimnego 10% roztworu kwasu trój chlorooctowego, następnie odwirować homogenat. Ciecz nadosadową usunąć, do osadu dodać 30 ml 0,6 M roztworu kwasu nadchlorowego i ogrzewać przez 15 minut w łaźni wodnej (90 stopni) mieszając. Po ostudzeniu odwirować osad, supernatant przenieść do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Uzupełnić kwasem nadchlorowym do kreski i dokładnie wymieszać. W tak otrzymanej próbie oznaczyć zawartość DNA.
Oznaczanie DNA:
Do 1 ml uzyskanego ekstraktu dodać 1 ml wody destylowanej. Następnie dodać 4 ml odczynnika difenyloaminowego. Próbę wstawić do wrzącej łaźni wodnej i inkubować przez 10 minut. Następnie ochłodzić i zmierzyć absorbancji przy długości fali 600 nm. Równolegle wykonać próbę wzorcową zawierającą 1 ml DNA o stężeniu 200 μg/ml zmieszany z 1 ml wody destylowanej. Dalej postępować analogicznie.
Wyniki:
Tabela 3 – Absorbancje prób badanych przy długości fali 600 nm
Materiał
Absorbancja
1
Absorbancja
2
Średnia
Średnia całkowita
Zawartość DNA
[mg/100g]
Mlecz ze śledzia
próba 1
0,570
0,599
0,585
0,591
972,84
Mlecz ze śledzia
próba 2
0,647
0,548
0,598
Wątroba
wieprzowa
próba 1
-
0,268
0,268
0,243
194,7
Wątroba
wieprzowa
próba 2
0,207
0,242
0,225
Przykład obliczeń dla próby z mleczem śledzia:
Wnioski:
Mlecz ze śledzia charakteryzuje się dużo wyższą zawartością DNA niż wątroba wieprzowa (972,84 w stosunku do 194,7 mg DNA/100 g materiału badanego). Doświadczenie to pozwoliło potwierdzić obecność kwasów nukleinowych w tkankach zwierzęcych.