Skrypt ZAwChK 12-11-2015

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

OPIS ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH Z ZAAWANSOWANEJ ANALIZY W CHEMII KOSMETYCZNEJ

Autorami opracowań poszczególnych ćwiczeń są: Szymon Bocian, Renata Gadzała-Kopciuch, Damian Grzywiński, Magdalena Ligor, Tomasz Ligor, Przemysław Kosobucki, Maciej Milanowski, Magdalena Skoczylas, Sylwia Studzińska, Radosław Sadowski, Michał Szumski, Justyna Walczak

1

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Spis treści:

Numer ćwiczenia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tytuł ćwiczenia Wyznaczanie hydrofobowości parabenów i ich identyfikacja w kremie do rąk metodą chromatografii cieczowej z detekcją spektrofotometryczną Identyfikacja i analiza ilościowa gliceryny w kremie do rąk metodą chromatografii cieczowej z detekcją refraktometryczną Analityka anionów nieorganicznych w różnych preparatach do zębów – ekstrakcja do fazy stałej w połączeniu z chromatografią jonową Oznaczanie pozostałości lotnych rozpuszczalników chloroorganicznych w surowcach za pomocą headspace i chromatografii gazowej z detektorem wychwytu elektronów Jakościowe i ilościowe oznaczanie kofeiny w wybranych kosmetykach za pomocą technik elektromigracyjnych Oznaczanie parabenów w wybranych kosmetykach za pomocą technik elektromigracyjnych Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej w oznaczaniu kwasów karboksylowych w produktach kosmetycznych Wyznaczanie sumarycznej zawartości związków organicznych w preparatach kosmetycznych Klasyczne metody analityczne w określaniu zawartości nadtlenku wodoru w wodzie utlenionej Oznaczanie sodu w preparatach kosmetycznych za pomocą fotometrii płomieniowej Zawartość glukozy w peelingach cukrowych – analiza spektrofotometryczna Izolowanie detergentów z płatków do demakijażu i żeli za pomocą ekstrakcji ciecz-ciecz i identyfikacja za pomocą spektrofotometrii UV-Vis

strona 3 10 20 23 28 43 61 70 72 75 80 86

UWAGA!!! Wstępy teoretyczne stanowią uzupełnienie informacji dla studenta i nie są wystarczające do przygotowania teoretycznego oraz nie zastąpi studiowania literatury z podanego poniżej zakresu materiału naukowego!

2

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 1 WYZNACZANIE HYDROFOBOWOŚCI PARABENÓW I ICH IDENTYFIKACJA W KREMIE DO RĄK METODĄ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Z DETEKCJĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ Wstęp Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą a stacjonarną układu chromatograficznego. Chromatografią cieczową nazywamy chromatografię, w której fazą ruchomą jest ciecz lub mieszanina cieczy. Wysokosprawna chromatografia cieczowa - HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography) to technika stosowana do badania czystości, oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych. HPLC jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. W tego rodzaju chromatografii faza stacjonarna upakowana jest w kolumnie chromatograficznej, przez którą przepuszczana jest faza ruchoma. HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem, które powoduje przepływ fazy ruchomej przez kolumnę. Opór przepływu powoduje ciśnienia przekraczające zazwyczaj 50 atm. W zależności od długości kolumny, szybkości przepływu i wielkości ziaren adsorbentu w kolumnie. Wysokie ciśnienie w układzie HPLC wynika również z budowy pomp HPLC - wąskie przekroje kapilar. Drobne uziarnienia złoża fazy stacjonarnej skutkuje korzystniejszymi parametrami sprawności i rozdzielczości układu HPLC dzięki czemu uzyskujemy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu fazy ruchomej i mniejszej ilości analizowanej próbki niż w klasycznej chromatografii kolumnowej. Zdolności rozdzielcze współczesnych aparatów i kolumn HPLC są niekiedy porównywalne do zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej. W najnowszych aparatach przy zastosowaniu kolumn o ziarnie poniżej 2 μm osiągane są ciśnienia rzędu 1000 atm. Rolę fazy ruchomej w układzie HPLC pełni odpowiednio dobrany rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników (tzw. eluent). Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdzielenie. Obecnie chromatografię cieczową możemy podzielić na trzy układy faz, w których dokonuje się procesu rozdzielania. Układy te różnią się mechanizmem retencji analitów i selektywnością, a przez to również zastosowaniem.  Chromatografia w odwróconym układzie faz (RP HPLC), w którym faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna. W takim układzie fazę stacjonarną najczęściej stanową fazy alkilowe zawierające łańcuchy od 4 do 30 atomów węgla (np. fazy C18) a fazę ruchomą stanowią mieszaniny wody i rozpuszczalnika organicznego, najczęściej metanolu i acetonitrylu. Retencja substancji wzrasta wraz ze wzrostem ich hydrofobowości i maleje wraz ze wzrostem zawartości modyfikatora organicznego w fazie ruchomej.  Chromatografia w normalnym układzie faz (NP HPLC), w którym faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma. W takim układzie fazą stacjonarną jest najczęściej czysta krzemionka lub krzemionka modyfikowana za pomocą polarnych cząsteczek organicznych zawierających grupy aminowe lub hydroksylowe (diolowe) a fazę ruchomą stanowią mieszaniny niepolarnych lub mało polarnych rozpuszczalników organicznych takich jak heksan, toluen, propan-2-ol, octan etylu. Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych (HILIC) to układ, w którym 3

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

faza stacjonarna jest polarna (fazy stacjonarne używane w układzie faz normalnych) natomiast fazę ruchomą stanowią najczęściej mieszaniny wody i acetonitrylu, zawierające więcej niż 70% tego rozpuszczalnika organicznego. Retencja substancji wzrasta wraz ze wzrostem ich polarności i maleje wraz ze wzrostem zawartości wody w fazie ruchomej. Aparaty HPLC składają się zwykle z:  zbiornika na rozpuszczalniki i bufory stanowiące fazę ruchomą i odpowiednie roztwory płuczące itp.  automatycznego systemu do odgazowania fazy ruchomej, który usuwa gazy rozpuszczone w rozpuszczalnikach (jeżeli w strumieniu fazy ruchomej pojawiają się pęcherzyki powietrza, mogą one silnie zakłócać proces rozdzielenia na kolumnie i detekcji wymywanych składników)  zaworów gradientowych odpowiadających za dobranie składu rozpuszczalników stanowiących fazę ruchomą. Ma to szczególne znaczenie w analizach gradientowych (tzw. gradient niskociśnieniowy, gdyż mieszanie składników fazy ruchomej następuje przed pompą, (w obszarze niskiego ciśnienia). W przypadku tzw. gradientu wysokociśnieniowego najczęściej stosuje się dwie identyczne pompy dla obu mieszanych rozpuszczalników a mieszanie następuje w specjalnym mieszalniku za pompami (w obszarze wysokiego ciśnienia). Układ z zaworami zazwyczaj umożliwia mieszanie 4 roztworów, podczas gdy układ wysokociśnieniowy najczęściej dwóch. Zaletą mieszania wysokociśnieniowego jest szybsza zmiana składu fazy ruchomej (dzięki znacznie mniejszej objętości układu między mieszalnikiem a kolumną).  Pompy lub układ pomp zapewniających odpowiednie parametry przepływu fazy ruchomej przez układ chromatograficzny. Szczególnie istotny jest stabilny przepływ objętościowy.  Pętli dozującej lub automatycznego dozownika próbek umożliwiającego wprowadzanie analizowanych próbek do układu chromatograficznego będącego pod wysokim ciśnieniem.  Odpowiednich filtrów i przedkolumny, które usuwają z fazy ruchomej zanieczyszczenia mechaniczne, które mogłyby uszkodzić wypełnienie kolumny lub doprowadzić do jej zapchania. Jako przedkolumny najczęściej stosuje się wypełnienie identyczne lub porównywalne ze stosowaną kolumną chromatograficzną.  Termostatu kolumn (pracującego w zakresie temperatur najczęściej od 5 do 80°C) termostatującego również fazę ruchomą przed wtłoczeniem do kolumny.  Detektora – którym może być przepływowy spektrofotometr UV-VIS lub fluorescencyjny, refraktometr, spektrometr mas, spektrometr rozproszenia światła lub amperometr (detektor elektrochemiczny).  Zbiornika na zużyte rozpuszczalniki. Z punktu widzenia mechanizmu retencji i rozdzielenia, chromatografię cieczową można podzielić na:  adsorpcyjną, w której rozdzielenie odbywa się w wyniku różnego powinowactwa adsorpcyjnego składników mieszaniny do odpowiednio dobranej fazy stacjonarnej (adsorbentu);  podziałową, w której rozdzielanie wynika z różnych wartości współczynnika podziału składników mieszaniny między dwie niemieszające się fazy, z których jedną jest chemicznie związana faza stacjonarna (ciecz na nośniku) a drugą faza ruchoma;

4

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

 

jonowymienną, w której podstawą rozdzielania są różnice w energii oddziaływań międzycząsteczkowych pomiędzy jonami z próbki a jonami związanymi z fazą stacjonarną (jonitem) i jonami będącymi składnikiem fazy ruchomej a jonitem. sitową, zwaną inaczej chromatografią żelową, sączeniem molekularnym lub chromatografią wykluczania. W tym układzie o rozdzielaniu składników mieszaniny decydują rozmiary ich cząsteczek.

Metody analizy jakościowej Podstawą analizy jakościowej (identyfikacji pików) odpowiadających poszczególnym składnikom próbki, są wielkości retencyjne. Analizy dokonuje się porównując czas retencji piku identyfikowanej substancji z czasem retencji piku wzorca. Analiza musi być przeprowadzona w identycznych warunkach chromatograficznych. Najlepszym rozwiązaniem jest, aby porównanie wykonać dla dwóch różnych składów fazy ruchomej, ponieważ istnieje ryzyko przypadkowej zgodności parametrów retencyjnych dla różnych substancji w danych warunkach chromatograficznych. Należy również pamiętać, że retencja może zmieniać się w niewielkim stopniu między analizą mieszaniny lub próbki rzeczywistej a analizą substancji wzorcowej. Analizę taką można przeprowadzić również przez dodatek wzorca do próbki i porównanie chromatogramów próbki pierwotnej i próbki z dodatkiem wzorca. Zwiększenie intensywności piku identyfikuje go jako substancję wzorcową. Analizę taką najlepiej przeprowadzić dla dwóch różnych składów fazy ruchomej. Lipofilowość, inaczej lipofilność – to skłonność cząsteczek chemicznych do rozpuszczania się w tłuszczach, olejach oraz rozpuszczalnikach niepolarnych jak heksan czy toluen. Cząsteczki lub fragmenty cząsteczek lipofilowych są najczęściej hydrofobowe i niepolarne, ale pojęcia te nie są tożsame. Pojęciem przeciwstawnym do lipofilowości jest lipofobowość (hydrofilowość). Lipofilowość jest głównym parametrem decydującym o retencji substancji w chromatografii cieczowej w układzie odwróconych faz (RP HPLC). Lipofilowość jest wyznaczana przez procesy podziałowe między dwiema fazami: niepolarną (organiczną) i polarną (najczęściej wodną). Przyjęto, że rozpuszczalnikami najlepiej odwzorowującymi układ faz polarnych i niepolarnych w ustroju biologicznym oraz środowisku naturalnym są n-oktanol oraz woda. Rozpuszczalniki te po zmieszaniu tworzą dwie nie mieszające się fazy. W rzeczywistości ze względu na wzajemną częściową rozpuszczalność jest to układ zawierający oktanol nasycony wodą (2,3 mol/L) oraz wodę nasyconą oktanolem (4,5x10-3 mol/L). Współczynnik podziału P jest wyrażany ilorazem dwóch stężeń substancji rozpuszczonej: 𝐿𝑜𝑔𝑃 =

𝐶𝑜𝑘𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝐶𝑤𝑜𝑑𝑎

(1)

gdzie: Coktanol – stężenie molowe substancji w oktanolu [mol/l], Cwoda - stężenie molowe substancji w wodzie[mol/l]. Parabeny pod względem chemicznym to pochodne estrów kwasu phydroksybenzoesowego, różniące się podstawnikiem przy grupie alkilowej (metylo-, etylo-, propylo-, butyloparaben) (Rys. 1). Parabeny (aseptyki) są to bezbarwne ciała stałe, słabo rozpuszczalne w wodzie ale dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych.

5

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki O OR HO

Rys.1 Ester kwasu p-hydroksybenzoesowego, gdzie R oznacza odpowiednią grupę alkilową.

W przemyśle farmaceutyczny, kosmetycznym i spożywczym, parabeny są głównie wykorzystywane jako środki antyseptyczne i konserwujące ze względu na swoje właściwości antybakteryjne (głównie w przypadku bakterii Gram dodatnich). Ze względu na szerokie spektrum działania i brak interakcji z innymi substancjami, są wykorzystywane w wielu produktach. Wraz ze wzrostem długości łańcucha alkilowego wzrasta aktywność parabenów jak również maleje ich rozpuszczalność w wodzie. W preparatach kosmetycznych, parabeny można spotkać przede wszystkich w dezodorantach i antyperspirantach, jak również w kremach, mleczkach, szamponach, pomadkach do ust, podkładach i pudrach. Ich głównym zadaniem jest niedopuszczenie do powstawania pleśni oraz zahamowanie rozwoju drobnoustrojów (np. gronkowiec złocisty Staphylococcus aureus, pałeczki ropy błękitnej Pseudomonas aeruginosa), tym samym wydłużają one datę przydatności do użycia danego kosmetyku. W kosmetyce najczęściej wykorzystuje się metylo- i propyloparaben. Pochodna propylowa jest skuteczna wobec bakterii Gram dodatnich i pleśni, natomiast pochodna metylowa wykazuje umiarkowaną aktywność przeciwdrobnoustrojową. Wg. Amerykańskiej Agencji Żywności i Leków (Food and Drug Administration) średnia dawka parabenów przyjmowana dziennie przez człowieka wynosi około 76mg (1 mg pochodzi z żywności, 50mg z kosmetyków i 25mg z leków. Parabeny w organizmie ludzkim są hydrolizowane poprzez esterazy do kwasu p-hyroksybenzoesowego lub jego pochodnych, a wydalane są z organizmu z moczem. Część eksperymentalna Cel ćwiczenia Analizę parabenów techniką HPLC prowadzi się w odwróconym układzie faz. Ten typ chromatografii nadaje się do rozdzielania mieszanin związków niepolarnych i słabo polarnych. Jako fazy stacjonarne stosuje się najczęściej kolumny oktadecylowe (C18, ODS) a jako fazy ruchome stosuje się wodę, acetonitryl, metanol oraz ich mieszaniny. Celem ćwiczenia jest poznanie budowy i działania wysokosprawnego chromatografu cieczowego, rozdzielenie i identyfikacja parabenów oraz wyznaczanie ich współczynników lipofilowości. Zakres materiału naukowego Chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz, fazy stacjonarne, budowa chromatografu cieczowego, parametry chromatograficzne: czas retencji, współczynnik retencji, liczba półek teoretycznych, rozdzielczość, selektywność, symetria piku, hydrofobowość, wpływ składu fazy ruchomej na retencję

Sprzęt i odczynniki  chromatograf cieczowy wyposażony w pompę tłokową firmy Shimadzu model 20AD, zawór dozujący Rheodyne, kolumnę chromatograficzną oraz detektor spektrofotometrycznego UV-VIS w zakresie długości fal 190-600 nm firmy Shimadzu (długość fali detekcji λ = 254 nm),  strzykawka chromatograficzna,  fiolki szklane,  metanol i woda do HPLC. 6

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Do analizy zostanie wykorzystana kolumna analityczna o wymiarach 125 x 4,6 mm. Wypełnienie stanowi chemicznie związana faza stacjonarna RP C18 (żel krzemionkowy z chemicznie związanymi grupami oktadecylowymi). Średnica ziaren 5 μm. Fazami ruchomymi są mieszaniny metanol/woda w stosunku 80:20, 70:30, 60:40 i 50:50 % v/v przy przepływie 1 ml/min. Czas retencji około 1,38 min. Wykonanie ćwiczenia Przygotowanie próbki Do probówki typu Eppendorf odważyć 0,2 g kremu do rąk. Dodać 2 ml metanolu. Całość wymieszać do całkowitego rozpuszczenia kremu (do uzyskania klarownego roztworu). Roztwór przefiltrować przez filtr strzykawkowy do fiolki szklanej. Wykonanie analiz chromatograficznych  Przepłukać zestaw fazą ruchomą o składzie 80:20 % v/v przez ok. 15 min do momentu ustabilizowania linii bazowej.  Wprowadzić do dozownika roztwór próbki po uprzednim przemyciu strzykawki i pętli dozownika. Trzy razy wprowadzić po 20 μl do pętli dozowanika analizowaną próbkę. Z chromatogramu odczytać czasy retencji substancji. Analizę wykonać trzykrotnie.  Przed analizą należy przemyć kilkakrotnie badaną próbą strzykawkę i pętlę dozownika. Następnie wprowadzić do dozownika roztwór substancji wzorcowej 20 μl (metyl- i propylparaben). Z chromatogramu odczytać czasy retencji substancji wzorcowych. Analizę wykonać trzykrotnie dla każdego z roztworów wzorcowych.  Analizę wykonać dwukrotnie dla próbki badanej i roztworów wzorcowych przy różnych składach fazy ruchomej (80:20, 70:30, 60:40 i 50:50 % v/v). Opracowanie wyników:  Na podstawie otrzymanych wyników wyznaczyć:  współczynnik retencji k każdego ze związków dla każdego składu fazy ruchomej;  liczbę półek teoretycznych N;  rozdzielczość między analizowanymi substancjami RS  Wykreślić krzywą zależności logk od procentowego udziału MeOH w fazie ruchomej. obliczyć współczynniki a i b z równania prostej: , w którym φ to zawartość rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej a parametr b opisuje wartość log k ekstrapolowanego do czystej wody jako fazy ruchomej (log kw)  Wyznaczyć parametr logP dla obu analizowanych substancji na podstawie korelacji: 𝑙𝑜𝑔𝑘𝑤 = 1,016𝑙𝑜𝑔𝑃 + 0,098  

(2)

Porównać wyznaczoną wartość parametru lipofilowości logP z danymi literaturowymi dla analizowanych parabenów Omówić otrzymane wyniki i wyciągnąć wnioski.

Literatura: 1. Z. Witkiewicz, J. Kałużna-Czaplińska, Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, WNT 2. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN 3. R. Rosset, H. Kołodziejczyk, Współczesna chromatografia cieczowa ćwiczenia i zadania, PWN

7

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Instrukcja obsługi LC z detektorem UV Po uruchomieniu komputera kliknij dwukrotnie na ikonę Okno główne LabSolution wygląda następująco:

(LabSolutions) na pulpicie.

Następnie włącz przycisk „on” na pompie, detektorze i termostacie

TERMOSTAT

POMPA

DETEKTOR

Po załadowaniu systemu (czerwona kontrolka przestanie migać), wybierz i kliknij dwukrotnie ikonę HPLC-UV

.

Upewnij się, że aparat ma status [Ready] w oknie [Data Acquisition].

Opis okna [Data Acquisition] 8

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Płukanie kanałów. W tym celu należy przekręcić zawór (A) w lewą stronę o 90°C (B) (jak na rysunku) i nacisnąć przycisk „purge”. B A

Po przepłukaniu kanału, wrócić do pozycji wyjściowej - przekręcić ponownie zawór o 90°C w prawą stronę.  W zakładce Pump i ustawić żądany przepływ i skład fazy ruchomej

9

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

W czerwonym polu wpisać przepływ fazy ruchomej (używając przecinków), w niebieskim polu wpisać procentowy udział fazy ruchomej B (automatycznie jest wpisywany udział procentowy składnika A, np. faza ruchoma 70% A : 30% B, wpisujemy 30% w niebieskie pole). Po wpisaniu wszystkich parametrów naciskamy Download.  W zakładce Detector A w czerwone pole wpisujemy żądaną długość fali i naciskamy Download.:



W zakładce Column Oven w czerwonym polu wpisujemy temperaturę termostatu i naciskamy Download.

Po wpisaniu wszystkich parametrów włączamy ikonę pompy

w oknie [Data Acquisition]. I

czekamy 10 minut na ustabilizowanie się linii bazowej. Po tym czasie umieszczamy strzykawkę w zaworze, wciskamy tłok wprowadzając analizowaną substancję do pętli dozownika (Nie wyciągamy strzykawki!!!). Naciskamy przycisk Start Single Run (po lewej stronie okna Data Acquisition). Pojawia na się okno w którym wpisujemy nazwę analizowanej substancji (zaznaczone na czerwono) oraz objętość dozowania (zaznaczone na niebiesko), naciskamy przycisk OK.

10

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Po pojawieniu się komunikatu

przekręcamy zawór z pozycji 0 na 1 (jak na zdjęciu poniżej).

Po skończonej analizie wciskamy przycisk STOP (po lewej stronie) oraz przekręcamy zawór z pozycji 1 na 0 i wyciągamy strzykawkę. W celu zebrania danych wciskamy Data Analysis. Po lewej stronie wybieramy folder w którym zapiane były nasze analizy. Po skończonej analizie, płuczemy kolumnę fazą ruchomą, wyłączamy pompę oraz termostat w oknie dialogowym [Data Acquisition]. Następnie wyłączamy program Lab Solution oraz LC (detektor, pompę i termostat).

11

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 2 IDENTYFIKACJA I ANALIZA ILOŚCIOWA GLICERYNY W KREMIE DO RĄK METODĄ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Z DETEKCJĄ REFRAKTOMETRYCZNĄ Wstęp Ilościową zawartość składników w próbce oblicza się, wykorzystując to, że ilość tych składników jest proporcjonalna do powierzchni pików odpowiadających danym substancjom. Do obliczeń można wykorzystać wysokości pików pod warunkiem, że są one symetryczne a kolumna jest sprawna. Na wyniki analizy chromatograficznej wpływ ma jakość zastosowanego przyrządu (czułość) oraz stałość warunków prowadzenia analizy. W czasie analizy temperatura kolumny, skład fazy ruchomej i objętości dozowanych próbek do kolumny nie powinny ulegać zmianie. W chromatografii cieczowej analizę ilościową można wykonać przez porównywanie powierzchni piku substancji analizowanej i powierzchni pików zarejestrowanego dla serii wzorców o danych stężeniu. Jest to metoda krzywej kalibracyjnej (kalibracji bezwzględnej). Stężenie można wyznaczyć graficznie (odczytać z wykresu krzywej kalibracyjnej) znajdując stężenia, dla którego powierzchnia piku jest równa powierzchni zarejestrowanej przez aparat. Możliwe jest również wyznaczenie równania krzywej kalibracyjnej i na jego podstawie wyznaczenie stężenia dla danej powierzchni piku. punkty pomiarowe lina trendu

5000

powierzchnia piku oznaczanej substancji

powierzchnia piku

4000

3000

2000

stężenie oznaczanej substancji

1000

1

2

3

4

5

stężenie [g/ml]

Rys. 1. Krzywa kalibracyjna. Analizę ilościową można również przeprowadzić metodą dodawania (dodatku) wzorca. Procedura oznaczeń w metodzie dodawania wzorca jest następująca:  przygotowujemy próbkę analizowaną i przeprowadzamy dla niej pomiar, mierząc wartość S0 (powierzchnia piku),  do tej samej próbki dodajemy znaną ilość substancji oznaczanej (wzorca), roztwór mieszamy i mierzymy wartość Si. Wartość parametru mierzonego wzrasta, a wzrost jest proporcjonalny do ilości dodanego wzorca.

12

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Stężenie substancji można wyliczyć na podstawie równań: S0 = ac

(1)

Si = a(c+cs)

(2)

gdzie: S0 - oznacza pole powierzchni sygnału chromatograficznego danej substancji zmierzone dla próbki bez dodatku wzorca, Si – pole powierzchni sygnału chromatograficznego analitu zmierzony dla próbki po dodaniu wzorca, c – stężenie analitu w próbce, cs – stężenie wzorca w próbce.

Z równania (1) obliczymy a: a = S0 / c

(3)

Po podstawieniu do równania (2) otrzymamy Si = S0 / c · (c + cs)

(4)

Po rozwiązaniu równania (4) względem c uzyskamy: c = S0 ·cs / (Si – S0)

(5)

Wynikiem dodania wzorca jest zmiana objętości roztworu próbki badanej, stąd należy skorygować stężenia. W przypadku stosowania mikrostrzykawek i dozowania mikrolitrowych ilości wzorca do analizowanej próbki, które nie wpływają w zasadniczy sposób na zmianę objętości próbki, taka korekta objętości nie jest konieczna. Gliceryna (glicerol) należy do grupy alkoholi cukrowych (alkohol trójwodorotlenowy) (Rys. 1). Charakteryzuje się dobrą rozpuszczalnością w wodzie oraz tłuszczach. Jest przezroczysta, tłusta w dotyku o silnych właściwościach higroskopijnych.

Rys. 1. Wzór glicerolu

Gliceryna jest obecna w większości kosmetyków, m.in. w kremach do rąk, szamponach, nawilżających żelach pod prysznic i balsamach do ciała, jak również znalazła zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i do produkcji barwników. Ze względu na swoje właściwości higroskopijne, gliceryna podobnie jak kwas hialuronowy jest wykorzystywana w kremach nawilżających, ponieważ umożliwia wiązanie wody w naskórku, dzięki temu skóra staje się sprężysta i nawilżona. Ponadto, gliceryna jest wykorzystywana w kosmetykach regenerujących, ponieważ na skórze tworzy ochronny film, który zapobiega przed szkodliwym działaniem czynników zewnętrznych oraz wzmacnia odporności skóry. 13

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Analizę chromatograficzną gliceryny można wykonać w trybie chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC). Jako fazę stacjonarną można zastosować krzemionkę modyfikowaną grupami aminowymi. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie budowy i działania wysokosprawnego chromatografu cieczowego, identyfikacja i oznaczenie ilościowe gliceryny w kremie do rąk metodą chromatografii cieczowej w trybie HILIC. Zakres materiału naukowego Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych, fazy stacjonarne, metody analizy ilościowej w HPLC (metoda krzywej kalibracyjnej, metoda dodatku wzorca), wpływ składu fazy ruchomej na retencję,

Sprzęt i odczynniki  chromatograf cieczowy - pomp tłokowych firmy Shimadzu model 20AD, zawór dozujący typu Rheodyne, termostat, kolumna chromatograficzna oraz detektora refraktometrycznego,  strzykawka chromatograficzna,  fiolki szklane, kolbki miarowe na 25 ml,  strzykawka i filtr strzykawkowy,  acetonitryl, metanol i woda do HPLC. Do analizy zostanie wykorzystana kolumna analityczna o wymiarach 125 x 4,6 mm. Wypełnienie stanowi aminopropylowa chemicznie związana faza stacjonarna (żel krzemionkowy z chemicznie związanymi grupami aminopropylowymi). Średnica ziaren 5 μm. Przygotowanie próbki Odważyć 0,3-0,4 g kremu do rąk bezpośrednio do kolbki miarowej na 10 ml. Dodać 5 ml metanolu. Całość wymieszać do całkowitego rozpuszczenia kremu (do uzyskania klarownego roztworu). Po całkowitym rozpuszczeniu uzupełnić acetonitrylem do kreski i wymieszać. Roztwór przefiltrować przez filtr strzykawkowy do szklanej fiolki. Przygotowanie roztworów do krzywej kalibracyjnej Wykorzystując roztwór podstawowy gliceryny o stężeniu 0,35 g/ml przygotować serię roztworów wzorcowych o stężeniach 0,14; 0,035; 0,014; 0,007 g/ml przez rozcieńczenie acetonitrylem w kolbkach miarowych 10 ml. Wykonanie analiz chromatograficznych  Kondycjonować kolumnę analityczną fazą ruchomą o składzie acetonitryl/woda o składzie 80/20 % v/v przy przepływie 0,5 ml/min przez ok. 15 min (do momentu ustabilizowania linii bazowej).  Przepłukać strzykawkę chromatograficzną i trzykrotnie wprowadzić 20 l analizowanej substancji do pętli dozownika.  Wprowadzić roztwór próbki za pomocą strzykawki chromatograficznej do dozownika.  Na podstawie chromatogramu odczytać czasy retencji substancji oraz powierzchnię piku. Dozowanie próbki powtórzyć trzykrotnie.  Wprowadzić do dozownika roztwór substancji wzorcowej o najniższym stężeniu. Przed analizą należy przemyć kilkakrotnie badaną próbą strzykawkę i pętlę 14

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki



dozownika. Z chromatogramu odczytać czas retencji i powierzchnię piku. Analizę wykonać trzykrotnie. Zidentyfikować pik pochodzący od gliceryny w próbce na podstawie czasu retencji. Analizę powtórzyć dla każdego stężenia substancji wzorcowej w kolejności rosnących stężeń z roztworem podstawowym włącznie.

Obliczenia  Na podstawie pól powierzchni pod pikiem wykreślić zależność pola powierzchni piku od stężenia gliceryny.  Wyznaczyć równie krzywej kalibracyjnej oraz obliczyć współczynnik determinacji. Na podstawie pola powierzchni piku gliceryny zidentyfikowanego w próbce wyznaczyć stężenie gliceryny w roztworze.  Na podstawie naważki kremu wyznaczyć zawartość gliceryny w kremie.  Omówić otrzymane wyniki i wyciągnąć wnioski

15

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Instrukcja obsługi LC z detektorem RID Po uruchomieniu komputera kliknij dwukrotnie na ikonę Okno główne LabSolution wygląda następująco:

(LabSolutions) na pulpicie.

Następnie włącz pompę, detektor i termostat

TERMOSTAT

POMPA

DETEKTOR

Po załadowaniu systemu (czerwona kontrolka przestanie migać), wybierz i kliknij dwukrotnie ikonę

HPLC-RID . Upewnij się, że aparat ma status [Ready] w oknie [Data Acquisition].

16

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki Opis okna [Data Acquisition] Termostat

Pompa

Base line

Parametry instrumentu, objętościowy przepływ eluentu, skład fazy ruchomej, temperatura pieca, długość fali zbierania danych przez detektor oraz inne parametry

Płukanie kanałów. W tym celu należy przekręcić zawór (A) w lewą stronę o 90°C (B) (jak na rysunku) i nacisnąć przycisk purge. B A

Po przepłukaniu kanału, wrócić do pozycji wyjściowej - przekręcić ponownie zawór o 90°C w prawą stronę.  W zakładce Pump i ustawić żądany przepływ i skład fazy ruchomej

17

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

W czerwonym polu wpisać przepływ fazy ruchomej (używając przecinków), w niebieskim polu wpisać procentowy udział eleuntu B fazy ruchomej (automatycznie jest wpisywany udział procentowy składnika A, np. faza ruchoma 70% A : 30% B, wpisujemy 30% w niebieskie pole). Po wpisaniu wszystkich parametrów naciskamy Download.  W zakładce Detector A w czerwone pole wpisujemy żądaną długość fali i naciskamy Download.:



W zakładce Column Oven w czerwonym polu wpisujemy temperaturę termostatu i naciskamy Download.

Po wpisaniu wszystkich parametrów włączamy ikonę pompy

w oknie [Data Acquisition]. I

czekamy 10 minut na ustabilizowanie się linii bazowej. Po tym czasie umieszczamy załadowaną strzykawkę w zaworze, wciskamy tłok wprowadzić analizowaną substancję do pętli dozowania (Nie wyciągamy strzykawki!!!). Naciskamy przycisk Start Single Run (po lewej stronie okna Data Acquisition). Pojawia na się okno w którym wpisujemy

18

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki nazwę analizowanej substancji (zaznaczone na czerwono) oraz objętość dozowania (zaznaczone na niebiesko), naciskamy przycisk OK.

Po pojawieniu się komunikatu

przekręcamy zawór z pozycji 0 na 1 (jak na zdjęciu poniżej).

Po skończonej analizie wciskamy przycisk STOP (po lewej stronie), oraz przekręcamy zawór z pozycji 1 na 0 i wyciągamy strzykawkę. W celu zebrania danych wciskamy Data Analysis. Po lewej stronie wybieramy folder w którym zapiane były nasze analizy. Po skończonej analizie, płuczemy kolumnę fazą ruchomą, wyłączamy pompę oraz termostat w oknie dialogowym [Data Acquisition]. Następnie wyłączamy program Lab Solution oraz LC (detektor, pompę i termostat).

19

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 3 ANALITYKA ANIONÓW NIEORGANICZNYCH W RÓŻNYCH PREPARATACH DO ZĘBÓW – EKSTRAKCJA DO FAZY STAŁEJ W POŁĄCZENIU Z CHROMATOGRAFIĄ JONOWĄ Wstęp Preparaty do pielęgnacji zębów i jamy ustnej Kosmetykami stosowanymi do pielęgnacji jamy ustnej są pasty do zębów, płyny do płukania jamy ustnej (tzw. płukanki), środki do fluoryzacji, wybielacze do zębów i środki do czyszczenia protez. Zadaniem preparatów do zębów jest utrzymanie czystości i właściwej mikroflory bakteryjnej jamy ustnej, a także zwiększać odporność zębów na próchnicę i przeciwdziałać odkładaniu się kamienia nazębnego. Dodatkowo płyny do płukania jamy ustnej działają odświeżająco i antybakteryjnie, niektóre z nich również przeciwpróchnicze. Kontaktowa fluoryzacja zębów ma zastosowanie w profilaktyce próchnicy, w przypadku niedorozwoju twardych tkanek zębów, przy nadwrażliwości szyjek zębowych, w odwapnieniach szkliwa, na wrażliwe powierzchnie zębów, startych klamrami, szynami, protezami częściowymi oraz aparatami ortodontycznymi a także po korekcie zgryzu urazowego. W przypadku past do zębów głównym składnikiem są substancje ścierno-polerujące np. węglan magnezu, kreda (węglan wapnia), ortofosforan (V) wapnia, tlenek magnezu, uwodniona krzemionka, wodoroortofosforan(V) wapnia, uwodniony tlenek glinu itp. Stanowią one 90% masy całej pasty. Reszta składników to: środki powierzchniowo-czynne, środki wiążące wodę, substancje koloidalne, zapachowe, smakowe, konserwujące, barwniki, środki wybielające (tj. chlorany, nadborany oraz inne nadtlenki zawierające stabilizowany nadtlenek wodoru), a także substancje o właściwościach:  antyseptycznych i profilaktycznych (sól kuchenna i morska, ekstrakty z różnych ziół np. nagietek, tymianek, rumianek, szałwia itp.),  przeciwzapalnych (np. azulen),  ściągających (np. tanina, związki glinu),  bakteriobójczych i przeciwpróchniczych (fluorki, monofluorofosforan sodu (MFP), N, N, N′-tri(2-hydroksyetyl)-N′-oktadecypropano-1,3-diamono difluorek itp.). Oznaczanie anionów w środkach do jamy ustnej i zębów Tak złożony skład środków do mycia zębów i pielęgnacji jamy ustnej wymaga zastosowania metod, które umożliwią oznaczenie wszystkich składników w próbce. Do tej pory stosowano: chromatografię gazową, elektrody jonoselektywne, metody spektrofotometryczne czy elektroforezę. Każda z metod ma swoje ograniczenia m.in. są pracochłonne i często trudne do zautomatyzowania. Co więcej w celu oznaczenia MFP wymagane jest zastosowanie hydrolizy z użyciem kwasu, w celu ustalenia zawartości fluorków. To pociąga za sobą trudność w określeniu rzeczywistych wartości fluorków ze względu na możliwość powstawania gazowego fluorowodoru, który będzie się ulatniał podczas procesu hydrolizy. Dobrym rozwiązaniem może być chromatografia jonowa (IC, ang. Ion Chromatography), która jako technika analityczna daje możliwość analizy zarówno anionów jak i kationów bez konieczności stosowania chemicznej obróbki (hydrolizy). Wśród zalet chromatografii jonowej można wymienić: szeroki zakres zastosowania, możliwość zastosowania różnych sposobów detekcji, możliwość analizy prostych i złożonych mieszanin w jednym czasie analizy, dobra precyzja i dokładność metody, dobra rozdzielczość i 20

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

selektywność, krótki czas analizy, mała objętość próbki, czy niskie koszty eksploatacji. Co więcej IC jest od kilku lat podstawową metodą do analizy anionów nieorganicznych w próbkach wody i ścieków. Najpoważniejsze wady chromatografii jonowej to: wysokie koszty samej aparatury oraz konieczność stosowania tłumienia (supresji) przewodności tła pochodzącego od fazy ruchomej. Chromatografia jonowa Chromatografia jonowa jest metodą rozdzielania mieszanin nieorganicznych i organicznych substancji jonowych (zarówno kationów jak i anionów). Rozdzielenie złożonej mieszaniny następuje dzięki zróżnicowanej szybkości retencji poszczególnych składników danej mieszaniny przez kolumnę chromatograficzną (stanowiącą fazę stacjonarną) w wyniku wymuszonego przepływu eluentu (czyli fazy ruchomej). Retencja jonów na wypełnieniu kolumny zależy nie tylko od: fazy stacjonarnej, fazy ruchomej i analitu, ale również od warunków prowadzenia samej analizy.

1

6

4

5

3

2

Rys. 1. Chromatograf jonowy ICS 1000 (Dionex, USA). 1 – panel kontrolny aparatu, 2 – zawory pompy, 3 – pętla dozująca, 4 – supresor, 5 – kolumna z przedkolumną, 6 – cela detektora konduktometrycznego.

21

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest praktyczne zapoznanie się z techniką chromatografii jonowej, jakościową i ilościową analizą anionów nieorganicznych obecnych w różnych preparatach do utrzymania higieny zębów i jamy ustnej (pasta do zębów, płyn do płukania jamy ustnej, żel do fluoryzacji). Zakres materiału naukowego Rodzaje chromatografii jonowej, wymiana jonowa, kationit, anionit, czynniki wpływające na retencję, tłumienie fazy ruchomej, detektor konduktometryczny, podział jonów, schemat blokowy chromatografu jonowego, rodzaje wypełnień kolumn chromatograficznych, współczynnik selektywności w chromatografii jonowej, metody detekcji w IC, rodzaje eluentów, supresja, wady i zalety IC. Wykonanie ćwiczenia PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY Aparatura, odczynniki i sprzęt laboratoryjny Pasta do zębów, płyn do płukania jamy ustnej, żel fluoryzujący, waga, wirówka, wytrząsarka, pipety Pasteura, pipety szklane, probówki wirówkowe typu Eppendorf, zlewki, szpatułka do odważania, zestaw do ekstrakcji do fazy stałej (SPE), chromatograf jonowy ICS 1000 (Dionex, Sunnyvale, USA). Przygotowanie próbek pasty do zębów Każda z próbek musi być wykonana co najmniej w dwóch powtórzeniach. Do probówki wirówkowe typu Eppendorf o obj. 15 ml odważyć 1g pasty do zębów. Następnie próbkę rozpuścić w 10 ml wody destylowanej. Próbkę wymieszać przy użyciu wytrząsarki typu Vortex. Następnie próbkę należy odwirować na wirówce przez 10 minut przy prędkości 4000 obr/min. Przygotowanie próbek płynu do płukania jamy ustnej Każda z próbek musi być wykonana w dwóch powtórzeniach. Do probówki wirówkowej typu Eppendorf o objętości 15 ml odmierzyć pipetą jednomiarową 2 ml płynu do płukania jamy ustnej i 8 ml wody destylowanej. Próbkę wymieszać przy użyciu wytrząsarki typu Vortex. Przygotowanie próbek żelu do fluoryzacji zębów Każda z próbek musi być wykonana co najmniej w dwóch powtórzeniach. Do probówki wirówkowe typu Eppendorf o objętości 50 ml odważyć 1g pasty do zębów. Następnie próbkę rozpuścić w 40 ml wody destylowanej. Próbkę dobrze wymieszać przy użyciu wytrząsarki typu Vortex. Następnie próbkę należy odwirować na wirówce przez 10 minut przy prędkości 4000 obr/min. Oczyszczanie próbek za pomocą SPE Każdą z przygotowanych próbek (pasta, płyn czy żel) należy poddać oczyszczeniu przy użyciu ekstrakcji do fazy stałej. Aparaturę do SPE należy skompletować i złożyć zgodnie z instrukcją prowadzącego. Etap I – kondycjonowanie Kolumienki z wypełnieniem oktadecylowym należy kondycjonować 2 x 2 ml metanolem oraz 2 x 2 ml wodą. Etap II – nanoszenie próbki Na kolumienkę nanieść porcjami około 2 ml roztworów badanych preparatów dentystycznych. Należy zebrać co najmniej 5 ml klarownego eluatu. 22

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki Jeżeli uzyskany eluat będzie mętny, próbkę należy oczyścić powtórnie, powtarzając całą procedurę od pierwszego etapu. Etap III – regeneracja złoża Kolumienki z wypełnieniem oktadecylowym należy poddać regeneracji kolejno 3 x 2 ml metanolu, 3 x 2 ml wody, 3 x 2 ml metanolu Analiza chromatograficzna Roztwory otrzymane po oczyszczeniu za pomocą SPE należy poddać dwukrotnie analizie chromatograficznej zgodnie z instrukcją obsługi (dostępna przy aparacie). Warunki analizy:  Faza ruchoma: 4,5 mM Na2CO3/1,4 mM NaHCO3  Kolumna chromatograficzna: Dionex IonPac AS22 (250 x 4 mm) z przedkolumną (50 x 4 mm),  Natężenie przepływu: 1,2 ml/min.

PRZYGOTOWANIE WZORCÓW Odczynniki i sprzęt laboratoryjny Podstawowe roztwory wzorcowe anionów (F-, Cl-, NO3-, SO42-, PO43-, MFP) o stężeniu 1000 mg/l, pipety szklane, kolbki miarowe, zlewki, Wykonanie krzywej wzorcowej W kolbie miarowej o objętości 500 ml należy przygotować mieszaninę wszystkich anionów o stężeniu 100 mg/l wykorzystując w tym celu roztówr podstawowe roztwory wzorcowe. Następnie w kolbkach miarowych o objętości 100 ml należy przygotować mieszaninę anionów o stężeniu 5, 20, 40, 60, 80 mg/l każdego z anionów. Tak przygotowane roztwory należy poddać dwukrotnie analizie chromatograficznej stosując identyczne warunki, jak podano w przypadku analizy próbek badanych. Opracowanie wyników i ich interpretacja Część doświadczalna raportu powinna zawierać:  opis wykonanych wszystkich czynności związanych z przygotowaniem próbki, wzorców i warunków analizy chromatograficznej,  zestawienie wszystkich otrzymanych wyników,  obliczenia zawartości wybranych anionów, podanych przez prowadzącego  przeprowadzenie interpretacji, dyskusji i porównania otrzymanych wyników. Literatura 1. R. Michalski, B. Mathews, Cental Eur. J. Chem., 4 (2006) 798-807. 2. A. Marzec, „Chemia kosmetyków – surowce, półprodukty, preparatyka wyrobów”, Wydawnictwo „Dom organizatora”, Toruń 2009. 3. Dionex AN 156, Determination of Anions in Toothpaste by Ion Chromatography, 2003, (http://www.dionex.com/en-us/webdocs/6522-AN156_LPN1548.pdf). 4. M. Borremans, J. Van Loco, P. Van Den Meerssche, J. Meunier, E.Vrindts, L. Goeyens, Int. J. Cosm. Sci. 30 (2008) 145-152. 5. Z. Witkiewicz, J. Kałuża-Czaplińska, „Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych”, Wydawnictwo WNT, Warszawa 2012. 6. R. Michalski, „Chromatografia jonowa”, Wydawnictwo WNT, Warszawa 2005 7. J. Weiss, “Handbook of Ion Chromatography”, Wiley VCH, 2005 8. D. Pogocki, „Wstęp do chromatografii jonowej”, Warszawa 1998

23

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 4 OZNACZANIE POZOSTAŁOŚCI LOTNYCH ROZPUSZCZALNIKÓW CHLOROORGANICZNYCH W SUROWCACH ZA POMOCĄ HEADSPACE I CHROMATOGRAFII GAZOWEJ Z DETEKTOREM WYCHWYTU ELEKTRONÓW (HS GC-ECD) Wstęp Rozpuszczalniki organiczne mają negatywny wpływ na organizm człowieka. Są używane w wielu gałęziach przemysłu a także w warunkach domowych (farby, lakiery, kleje, itd.). Zastosowanie przemysłowe rozpuszczalników jest ogromne. Wykorzystywane są niemal w każdej gałęzi przemysłu. Wykorzystywane są w syntezie organicznej jako medium reakcyjne, a także do oczyszczania produktów reakcji (krystalizacja). Stosowane są także w procesach ekstrakcji w celu pozyskiwania określonych surowców dla przemysłu farmaceutycznego i kosmetycznego (oleje, tłuszcze, woski, kofeina, flawonoidy, itd.). Użycie różnych rodzajów surowców czy ekstraktów w kosmetyce i farmacji, wymaga identyfikacji pozostałości rozpuszczalników i określenia ich zawartości. Obecnie najczęściej stosowane rozpuszczalniki to etanol, metanol, aceton, dichlorometan, dioksan, toluen i chloroform. Istnieje ciągłe dążenie do zwiększenia udziału rozpuszczalników o mniejszej toksyczności. Związki chlorowcoorganiczne (dichlorometan, chloroform) dzięki swoim właściwościom fizykochemicznym uznawane są za bardzo skuteczne rozpuszczalniki. Jednakże ich właściwości toksyczne wymagają skutecznych metod badania pozostałości rozpuszczalników w substancjach aktywnych leków i surowcach kosmetycznych. Metoda HS-GC Metoda analizy fazy gazowej (z ang. Headspace - HS) jest powszechnie wykorzystywana w przemyśle fermentacyjnym, spożywczym, farmaceutycznym i kosmetycznym. Służy głównie do badania jakości surowców i produktów fermentacji. Pozwala wydzielać i oznaczać lotne związki organiczne (LZO) w skomplikowanych próbkach. Oznaczanie możliwe jest poprzez pobranie niewielkiej objętości powietrza z nad próbki znajdującej się w szczelnym naczyniu. Metoda ta nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych, umożliwia natomiast zbadanie próbki z pominięciem wstępnego jej oczyszczania. Podstawy teoretyczne HS Metoda HS opiera się na prawie podziału Nernsta, zgodnie z którym w warunkach równowagi termodynamicznej (p, T = const), stosunek stężeń danego składnika w fazie ciekłej i w fazie gazowej jest stały i określany jako współczynnik podziału (K). 𝐶𝐿 𝐾= (1) C𝐺 gdzie: CL – stężenie składnika w fazie ciekłej, CG – stężenie składnika w fazie gazowej pozostającej w równowadze termodynamicznej z fazą ciekłą. Stosunek objętości gazu nad powierzchnią próbki jest określany jest jako współczynnik fazowy ():

24

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

𝛽=

𝑉𝐺 𝑉𝐿

(2)

gdzie: VL – objętość fazy ciekłej, VG – objętość fazy gazowej. Wzajemne korelacje dotyczące współczynnika podziału i współczynnika fazowego w zależności od stężenia analitu związane są z prężnością pary składnika i jego polarnością. Podstawą obliczeń w oznaczaniu ilościowym składnika lotnego występującego w próbce, za pomocą HS, określa równanie: 𝐶𝐿 = 𝐶𝐺  (K + )

(3)

gdzie: CL - stężenie składnika w próbce (ciecz lub ciało stałe), CG - stężenie w gazie (powietrzu) nad próbką). Praktyczne aspekty metody HS Czułość metody HS można zwiększyć, poprzez obniżenie K dla poszczególnych składników próbki. Wartość współczynnika K maleje wraz ze wzrostem stężenia składników w fazie gazowej. Efekt taki uzyskuje się poprzez zmianę pH analizowanego roztworu, podwyższenie temperatury lub zmianę siły jonowej roztworu (dodatek soli: KCl, Na2SO4, NaCl i innych). Próbki ciekłe poddawane analizie za pomocą HS powinny być jednorodne, a to samo dotyczy próbek stałych (proszki). Próbki mogą zawierać zanieczyszczenia stałe, ale należy unikać próbek zawierających emulsje lub plamy oleju. Użycie takiej próbki powoduje powstawanie błędów podczas analizy, spowodowanych zmianami w ustalaniu się równowagi w układzie. Próbki przeznaczone do analizy powinny być pobierane bezpośrednio przed analizą, w naczyniach szczelnie zamykanych. Przeniesienie próbki do fiolki HS i odmierzanie jej objętości powinny przebiegać w jak najkrótszym czasie, aby zminimalizować czas kontaktu próbki z powietrzem atmosferycznym, co może powodować straty oznaczanych składników. Do pobierania gazu nad powierzchnią próbki używa się strzykawki gazoszczelnej z teflonową uszczelką lub elektropneumatycznego układu dozującego, znajdującego się w automatycznych analizatorach HS. Warianty metody HS Badania techniką analizy fazy gazowej nad być prowadzone w układzie statycznym lub dynamicznym.

powierzchnią

próbki

mogą

Statyczna metoda HS Statyczna metoda HS (z ang. Static Headspace – SHS) należy do metod równowagowych i jest najczęściej używana w połączeniu z GC. Metoda ta polega na bezpośrednim oznaczeniu lotnych analitów w fazie gazowej pozostającej w równowadze z badaną próbką. W szczelnie zamkniętym szklanej fiolce HS, umieszcza się określoną ilość próbki i termostatuje w odpowiedniej temperaturze (rys. 1). Następnie pobiera się odpowiednią objętość gazu za pomocą gazoszczelnej strzykawki i dozuje do dozownika chromatografu gazowego. W celu wykonania analizy ilościowej stosuje się najczęściej metodę dodatku wzorca lub metodę wzorca wewnętrznego. Warunkiem koniecznym jest zachowanie stałej temperatury termostatowania i analogicznych warunków analizy. 25

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Rys. 1. Statyczna metoda HS. Dynamiczna metoda HS Dynamiczna metoda analizy fazy gazowej nad powierzchnią próbki (z ang. Dynamic Headspace – DHS) polega na przeniesieniu oznaczanych składników z próbki badanej do fazy gazowej, przy czym gaz pozostający w kontakcie z próbką może przepływać nad powierzchnią próbki lub w całej objętości próbki. Zalety DHS, w porównaniu z SHS, to większa czułość i możliwość analizowania znacznie mniejszych stężeń substancji. Badania z wykorzystaniem techniki HS mogą być prowadzone w układzie off-line (poza chromatografem), ale mogą również być zautomatyzowane poprzez bezpośrednie połączenie z chromatografem gazowym. Zalety i wady zastosowania metody HS Do zalet metod analizy fazy gazowej nad powierzchnią próbki zaliczyć należy możliwość wyodrębniania i szybkiego oznaczania lotnych składników z próbek o złożonym składzie bez konieczności użycia skomplikowanych procedur przygotowania próbki. Dzięki stosowaniu metody HS zwiększa się liczba możliwości zastosowania chromatografii gazowej do analizy próbek zawierających składniki uniemożliwiające bezpośrednią analizę chromatograficzną. Metoda HS pozwala na oznaczenie np. związków chlorowcopochodnych w surowcach farmaceutycznych czy kosmetycznych, wodzie, LZO w produktach kosmetycznych, pozostałości rozpuszczalników organicznych w produktach spożywczych, substancji ropopochodnych w glebie i inne. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie studentów z metodyką oznaczania pozostałości rozpuszczalników chloroorganicznych za pomocą HS GC-ECD. Studenci wykonują oznaczanie pozostałości chloroformu w wazelinie lub parafinie za pomocą manualnego HS. Zakres materiału naukowego Prawo podziału Nernsta i współczynniki podziału, ekstrakcja w układach ciecz–ciecz, ciecz–gaz, analityka lotnych związków organicznych, detektory specyficzne i uniwersalne, detektor wychwytu elektronów. 26

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Wykonanie ćwiczenia Aparatura i wyposażenie  Chromatograf gazowy Autosystem XL z detektorem wychwytu elektronów (Perkin Elmer, Norwalk, USA);  Integrator komputerowy z oprogramowaniem do sterowania GC i zbierania danych PE Nelson (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA);  Fiolki do HS (o pojemności 20 ml), uszczelki, kapsle, kapslownica;  Strzykawka gazoszczelna (VICI lub jej odpowiednik typu Hamilton).  Strzykawka do odmierzania cieczy - 10 µl (Agilent).  Igła medyczna do przebijania uszczelek we fiolkach HS.  Łopatka metalowa do odważania wazeliny. Warunki analiz Kolumna kapilarna: DB-5 (Agilent, USA) (20 m 0,18 mm 0,18 m); Gaz nośny i make-up gaz: azot (czystość 99,999%) - ciśnienie na głowicy kolumny ok. 100110 kPa, mierzone w temp. 40 oC; Dozownik split-splitless, temp. 100 oC; Detektor ECD: temp. 220oC; Temperatura kolumny: 40 oC izotermicznie przez 6 min. Przygotowanie próbek  Do fiolki o pojemności 20 ml odważyć ok. 300 mg próbki (wazelina lub maść).  Fiolkę zakapslować wkładając w odpowiedniej kolejności: gumowa uszczelka, krążek dociskowy i aluminiowy kapsel z otworem.  Fiolki pozostawić w temperaturze pokojowej na około 20 min. Wszystkie fiolki przygotować jednocześnie.  Przygotowanie otworu w membranie fiolki - przebić centralnie membranę za pomocą igły medycznej, następnie wcisnąć silnie igłę w membranę, aż do oporu. Obrócić kilka razy (5-, 6- krotnie) igłę w membranie trzymając fiolkę. Czynności powtórzyć z pozostałymi fiolkami. Uruchamianie GC-ECD Prowadzący reguluje gazy i włącza komputerowy integrator Nelson. Uwaga: nie wyłączać GC Perkin Elmer!!! Po włączeniu komputerowego integratora Nelson następuje automatyczne załadowanie metody do wykonania analiz. Następnie trzeba aktywować AutosystemXL do wykonywania analiz przez jednoczesne wciśnięcie na klawiaturze integratora przycisków Alt oraz R. (Nie zmieniać:) Ścieżka dostępu File Path: C\CHROM\ Nazwa piliku analizy: File Name: Kosme_A01 (nr próbki zmienia się automatycznie po włączeniu analizy). Method Name: Kosmet Opis próbki w polu Description: STD 2 l 1 (ilość dodanego wzorca w l i kolejne powtórzenie) Dla kolejnych wzorców wpisywać 4 l i 6 l.

27

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Wykonanie analiz Sprawdzić ciśnienie na lewym manometrze reduktora, które musi być wyższe niż 20 bar. Drugi manometr powinien wskazywać 3,5 bar. Następnie, wcisnąć przycisk Carrier Prog na panelu GC. Oba ciśnienia na górnej (103 kPa) i dolnej części wyświetlacza (100 kPa), powinny być zgodne i ewentualnie nie różnić się więcej niż 5 kPa. O komunikatach, wyświetlanych błędach na GC i integratorze informować prowadzących.  pobieranie próbek gazu z fiolek do analizy: trzymając fiolkę w dłoni, wprowadzić centralnie igłę przez membranę. Igłę należy wprowadzić do połowy jej długości. Powolnym ruchem pobrać 20 l gazu, a następnie z powrotem wcisnąć tłoczek do końca, cały czas trzymając igłę we fiolce (nie wyciągać igły z fiolki!!!). W ten sposób powietrze pozostaje we fiolce. Powtórzyć czynność 3 razu (przepłukiwanie strzykawki powietrzem z fiolki). Następnie pobrać i pozostawić w strzykawce 20 l gazu. Wyciągnąć powoli strzykawkę wraz z igłą z fiolki.  GC jest gotowe do dozowania, jeśli na monitorze i GC wyświetla się komunikat gotowości: READY. Pole komunikatu znajduje się bezpośrednio pod oknem z chromatogramem.  Wstrzykiwanie gazu do GC; tłoczek strzykawki delikatnie trzymać środkową częścią palca wskazującego, co zapobiega wystrzeleniu tłoczka z korpusu (ostrożnie!) strzykawki. Powoli przebić membranę wewnętrzną dozownika (czuć lekki opór) i wprowadzać igłę do otworu dozownika. Igłę wbijać tylko do połowy głębokości. Następnie wcisnąć tłok do końca, a po odliczeniu do 4 wyciągnąć strzykawkę. Wcisnąć przycisk RUN na panelu GC (włączona zostaje analiza i zbieranie danych). Uwaga: Nie zostawiać strzykawki w dozowniku.  Analizy chromatograficzne wykonać 3-krotnie dla każdej próbki (łącznie 12 analiz). Każda analiza wyłącza się automatycznie po 6 min. Po zakończeniu analizy, komputer automatycznie integruje piki i sprawdza warunki następnej analizy. Wykonanie analiz serii wzorców do kalibracji: 1. Do trzech fiolek (opatrzonych logo stylizowanym P) odważyć po ok. 300 mg wazeliny białej, co orientacyjnie odpowiada słupkowi wazeliny o długości ok. 2,5 cm. 2. Do pierwszej (wzorzec I) wprowadzić 2 l wzorca za pomocą strzykawki Agilent Technologies, wstrzykując roztwór bezpośrednio na powierzchnię wazeliny. Następnie delikatnie wymieszać bagietką. Z pozostałymi wzorcami postępować analogicznie, z tą różnicą że do drugiej fiolki wstrzyknąć 4 l wzorca w metanolu (wzorzec II), a do trzeciej 6 l wzorca (wzorzec II). 3. Każdorazowo, po dodaniu wzorca natychmiast zakapslować każdą z fiolek (patrz p. 2). Tak wykonane wzorce w zakapslowanych fiolkach zostawić przynajmniej na 20 min. 4. Każdy wzorzec analizować 3 krotnie (patrz p. 3). Integracja i przeglądanie wyników 1. Z głównego Menu wybrać opcję CHROMATOGRAM przejść do View → Select File i wybrać pojedynczy plik (pojedyncze kliknięcie). 2. Z Menu wybrać opcję DISPLAY przejść do Baseline. 3. Z Menu wybrać opcję Peak Data. Pojawia się kursor, którym najechać na odpowiedni pik i pojedynczo kliknąć. Odczytać RT i Area.

28

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

4. Z File wybrać kolejny plik do integracji, wybrać opcję Baseline, następnie Peak Data i najechać na pik. Po zakończeniu integracji wszystkich analiz wrócić głownego ekranu za pomocą: File → Quit. Tabela wyników: Uzupełnić tabelę w oparciu o pomiary GC (czasy retencji i powierzchnie pod pikiem). Wykreślić krzywą wzorcową. Na jej podstawie obliczyć zawartość chloroformu w próbce, przeliczając na 1 g maści. Lp. Chloroform 1.

2.

Wzorzec I Wzorzec II Wzorzec III Próbka maści/wazeliny

Stężenie Czas retencji Pole powierzchni Obliczone tR po pikiem próbce -

stężenie

w

Zestaw odczynników i strzykawek (przygotowuje osoba prowadząca):  Roztwór do kalibracji.  Kolba miarowa 10 ml zawiera roztwór podstawowy chloroformu w metanolu (10 µl w 10 ml metanolu), co odpowiada stężeniu chloroformu 147 ng/µl;  Badana maść lub wazelina w pojemniku zakręcanym.  Strzykawka chromatograficzna Agilent 10 µl do przygotowania wzorców.  Strzykawka gazoszczelna do wstrzykiwania gazów (headspace). Literatura: 1. Z. Brzózka [red.]; Miniaturyzacja w analityce, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa 2005. 2. J. Namieśnik, Z. Jamrógiewicz [red.]; Fizykochemiczne metody kontroli zanieczyszczeń środowiska, WNT, Warszawa, 1998.

29

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIA 5 JAKOŚCIOWE I ILOŚCIOWE OZNACZANIE KOFEINY W WYBRANYCH KOSMETYKACH ZA POMOCĄ TECHNIK ELEKTROMIGRACYJNYCH Wstęp Kofeina jest alkaloidem purynowym pochodzenia naturalnego, znajdowanym w wielu roślinach, np. kawie, herbacie czy yerba mate, z których sporządza się napoje mające działanie pobudzające. Działa stymulująco na centralny układ nerwowy do którego dostaje się z krwią po wchłonięciu w żołądku i jelicie cienkim. Poza wspomnianymi wyżej napojami kofeina jest również dodawana do napojów energetyzujących, napojów typu cola oraz sprzedawana w postaci czystej jako środek pobudzający. Może być także składnikiem niektórych leków. CH3 N

N

N H3C

O

N

CH3 O

Rys. 1. Wzór strukturalny kofeiny. Chociaż kofeinę można otrzymać na drodze syntezy, to głównym źródłem jej pozyskiwania jest dekofeinizacja np. kawy. Wyróżnia się tu trzy najważniejsze procesy: ekstrakcja wodą z zatrzymaniem kofeiny na węglu aktywnym, ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (dichlorometan, octan etylu) oraz ekstrakcja dwutlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym. Ten ostatni proces przeprowadza się na zielonych (niepalonych) ziarnach kawy z wysoką selektywnością i odzyskiem. Produktem są kofeina oraz kawa bezkofeinowa z zachowanym pełnym aromatem. Uzyskiwana w ten sposób kofeina może być stosowana min. w przemyśle farmaceutycznym oraz kosmetycznym. Chociaż dokładne mechanizmy działania kofeiny zawartej w kosmetykach nie są do końca poznane i wyjaśnione, obserwuje się liczne pozytywne efekty jej działania. Za najważniejsze uważa się:  działanie antycellulitowe (zapobieganie nadmiernej akumulacji tłuszczów, stymulowanie lipolizy, stymulowanie przepływu limfy w tkance tłuszczowej);  pozytywny wpływ na mikrokrążenie, redukcja opuchlizny wokół oczu;  własności antyoksydacyjne – dodatek kofeiny do kremów z filtrem UV zmniejsza ilość wytwarzanych wolnych rodników w komórkach skóry oraz chroni przed nowotworami wywołanymi promieniowaniem UV;  pozytywny wpływ na hamowanie łysienia i wzrost włosów (m.in. poprzez polepszenie mikrokrążenia w skórze głowy). Zawartość kofeiny w kosmetykach zazwyczaj wynosi (średnio) 3%. Przykładowe produkty to tonik do pielęgnacji włosów, szampon do włosów, krem/żel antycellulitowy. Zawartość kofeiny w różnych matrycach (żywność, kosmetyki, leki) oznaczana jest zazwyczaj za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z tym, że konieczne jest wcześniejsze wyizolowanie tego analitu z próbki w celu pozbycia się wielu substancji przeszkadzających. Alternatywą może być zastosowanie elektroforezy kapilarnej (CE) lub micelarnej chromatografii elektrokinetycznej (MEKC – micellar electrokinetic chromatography), przy których to technikach przygotowanie próbki może być niekiedy znacząco uproszczone.

30

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki Elektroforeza kapilarna to technika rozdzielania substancji obdarzonych ładunkiem w fazie ciekłej. Podstawą rozdzielania jest wykorzystanie różnic w prędkości migracji analizowanych indywiduów w polu elektrycznym. Rozdzielanie przeprowadza się w kapilarze o średnicy wewnętrznej zawierającej się w granicach 25-100 µm i długości od ok. 30 cm do ok. 100 cm. Kapilara wypełniona jest buforem separacyjnym o odpowiednim dla danego zadania analitycznego składzie, pH i stężeniu (sile jonowej) oraz w razie potrzeby zawierającego rozmaite dodatki. Umieszczone w kapilarze jonowe składniki próbki migrują w polu elektrycznym z prędkościami zależnymi od ich własnej ruchliwości elektroforetycznej (µEP) oraz przyłożonego pola elektrycznego (E): 𝑣𝐸𝑃 = 𝜇𝐸𝑃 𝐸

(1)

przy czym ruchliwość elektroforetyczna zależy od ładunku jonu (q) oraz jego wielkości (r): 𝜇𝐸𝑃 =

𝑞 6𝜋𝑟

(2)

W związku z tym, że podczas rozdzielania jony poruszają się w tym samym ośrodku (o lepkości ) i są pod wpływem tego samego pola E, ich szybkości migracji będą zależeć od stosunku ich ładunku do wielkości q/r. Wynika z tego, że najszybciej poruszają się jony małe o dużym ładunku, a najwolniej jony duże o ładunku małym. Substancje nieobdarzone ładunkiem (q=0) pozostają nierozdzielone. Rozdzielanie w warunkach elektroforezy kapilarnej przeprowadza się zazwyczaj w kapilarach kwarcowych. Ze względu na właściwości materiału w kapilarach obserwuje się zjawisko przepływu elektroosmotycznego (EOF – Electroosmotic Flow), który nie może być zaniedbany podczas rozdzielania. Przepływ elektroosmotyczny to objętościowy przepływ cieczy w strukturach kapilarnych (kapilarach, kanałach, ośrodkach porowatych) powstający pod wpływem różnicy potencjałów. Jego istnienie związane jest z tworzeniem podwójnej warstwy elektrycznej. Jest to konsekwencją zdolności grup silanolowych do dysocjacji (SiOH  Si-O- + H+) co powoduje, że od pH ok. 2,3 i powyżej kapilara zyskuje coraz większy ładunek ujemny. Kationy buforu przyciągane są do ścianki kapilary siłami elektrostatycznymi i tworzą nieruchomą, silnie związana warstwę Sterna. Nie kompensują one jednak w całości ładunku ścianki kapilary przez co może tworzyć się druga warstwa słabiej związana, nazywana warstwą dyfuzyjną. Jony tej warstwy biorą udział w zjawiskach elektrokinetycznych. Utworzona różnica potencjałów - miedzy związaną z powierzchnią warstwą jonów a głębią roztworu - nazywana jest potencjałem zeta (). Jest on proporcjonalny do gęstości ładunku na wewnętrznej powierzchni kapilary, co bezpośrednio związane jest z pH buforu wypełniającego kapilarę. Od wielkości potencjału zeta zależy prędkość przepływu elektroosmotycznego (vEOF): 𝑣𝐸𝑂𝐹 =

𝜀 𝐸 . 4𝜋

(3)

EOF największy wpływ mają: pH, siła jonowa buforu, lepkość, dodatki w postaci rozpuszczalników organicznych, środków powierzchniowo czynnych, polimerów obojętnych elektrycznie lub jonowych oraz chemiczne modyfikacje wewnętrznej powierzchni kapilary. EOF można obserwować w strukturach kapilarnych innych materiałów, nawet takich które uważane są za chemicznie obojętne, np. w kapilarach teflonowych. Za utworzenie podwójnej warstwy elektrycznej odpowiedzialna jest adsorpcja składników buforu na powierzchni takiej kapilary.

31

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

EOF 

+







--









































+

-

-

















+























++

+















Rys. 2. Kolejność migracji jonów podczas rozdzielania. EOF 

















obs =EOFEP EOF (-)

+

EP





-

(-)



































(-)





obs =EOF













+











obs =EP +EOF EOF (+) EP (+)

(0)









(+)









Rys. 3. Rzeczywista a obserwowana ruchliwość elektroforetyczna. Prędkość przepływu elektroosmotycznego w kapilarach kwarcowych przy pH ok. 8-9 jest na tyle duża, że do detektora (umieszczonego przy katodzie) docierają także aniony o względnie dużej ruchliwości elektroforetycznej. Za pomocą CE, w obecności EOF, można więc rozdzielać podczas jednej analizy kationy i aniony. W takim przypadku mówi się o ruchliwościach obserwowanych (obs), będących wypadkową własnych ruchliwości elektroforetycznych jonów oraz ruchliwości elektroosmotycznej. W warunkach elektroforezy kapilarnej nie można rozdzielić substancji neutralnych, nieobdarzonych ładunkiem – migrują one z prędkością EOF. Rozwiązaniem może być zastosowanie jednej z technik pochodnych – micelarnej chromatografii elektrokinetycznej (MEKC – Micellar Electrokinetic Chromatography). W MEKC do buforu dodaje się środka powierzchniowo czynnego. Cząsteczka środka powierzchniowo czynnego zbudowana jest z długiego, hydrofobowego łańcucha węglowodorowego (lub innej struktury), na którego jednym z końców znajduje się polarna grupa funkcyjna. Dzięki obecności grupy o charakterze polarnym substancje takie są rozpuszczalne w wodzie. Jeśli zostanie przekroczone tzw. krytyczne stężenie micelarne (CMC) cząsteczki środka powierzchniowo czynnego organizują się w struktury zwane micelami. Micele, charakteryzujące się kulistym lub elipsoidalnym kształtem, zbudowane są z określonej (zazwyczaj) liczby cząsteczek środka powierzchniowo czynnego w ten sposób, że hydrofobowe „ogony” skierowane są do wnętrza miceli, natomiast hydrofilowe „głowy” – na zewnątrz. Liczba cząsteczek środka powierzchniowo czynnego tworzącego micelę nazywana jest liczbą agregacji i podobnie jak CMC jest charakterystyczna dla danej substancji. Micela ma więc hydrofobowe wnętrze, a dzięki hydrofilowej powierzchni jest dobrze rozpuszczalna w wodzie. Anality obojętne mogą wnikać do hydrofobowego wnętrza miceli ulegając w ten sposób podziałowi między fazę wodną (otaczający micelę bufor) a fazę niepolarną (wnętrze miceli). Micele pełnią rolę podobną co chemicznie związana hydrofobowa faza 32

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki stacjonarna w chromatografii cieczowej. Z tego względu w MEKC micele zwane są „fazą pseudostacjonarną”. W związku z tym, że micele posiadają ładunek elektryczny migrują w kierunku detektora z własną ruchliwością wypadkową. W warunkach MEKC możliwe jest rozdzielanie kationów, anionów i substancji neutralnych. Mechanizm rozdzielania jest mieszany: dla niektórych analitów jest czysto elektroforetyczny, dla innych (neutralnych) podziałowy (podobnie jak w chromatografii), a dla jeszcze innych będący wypadkową działania tych dwóch mechanizmów. Na stałą podziału między micele a bufor można wpływać poprzez dodatek do buforu niewielkiej ilość rozpuszczalnika organicznego, np. metanolu lub acetonitrylu. Ilość ta zazwyczaj nie przekracza kilkulub kilkunastu procent ze względu na możliwość zniszczenia struktur micelarnych. Aparaturę do elektroforezy kapilarnej przedstawiono na rysunku 4 oraz na załączonym niżej schemacie z programu ChemStation.

Rys. 4. Schemat aparatu do elektroforezy kapilarnej.

Miniaturowe techniki separacyjne, do których należy CE, wymagają stosowania specjalnie zaprojektowanych układów detekcyjnych. Najczęściej stosowanymi detektorami są: spektrofotometryczny UV-Vis, fluorescencyjny, spektrometr mas i konduktometryczny (kontaktowy i bezkontaktowy). Największy problem z najpopularniejszą detekcją spektrofotometryczną związany jest z krótką drogą optyczną (w przypadku detekcji oncolumn jest ona równa wewnętrznej średnicy kapilary/kolumny), co w bezpośredni sposób wpływa na czułość. Za najczulszy detektor stosowany w technikach mikroseparacyjnych uważa się detektor z laserowo wzbudzoną fluorescencją (LIF), jednak osiągane tu wysokie czułości są ściśle związane z odpowiednim zaprojektowaniem i jakością układu optycznego. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest oznaczenie zawartości kofeiny w wybranych kosmetykach do pielęgnacji włosów metodą micelarnej chromatografii elektrokinetycznej. Zakres materiału Techniki elektromigracyjne – wiadomości ogólne, elektroforeza kapilarna (CE), micelarna chromatografia elektrokinetyczna (MEKC), ruchliwość elektroforetyczna, przepływ elektroosmotyczny, mechanizm rozdzielania w CE i MEKC, środek powierzchniowo czynny, micela (liczba agregacji, krytyczne stężenie micelarne), budowa aparatu do CE, sposoby detekcji w technikach elektromigracyjnych Aparatura i sprzęt laboratoryjny 33

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

1. Aparat do elektroforezy kapilarnej Agilent Technologies. 2. Kapilara kwarcowa o średnicy wewnętrznej dc = 50 m, długości całkowitej Ltot = 64,5 cm i długości efektywnej Leff = 56 cm. 3. Kolby miarowe na 50 ml – 2 szt., kolby miarowe na 10 ml – 6 szt. 4. Fiolki na 20 ml – 6 szt. 5. Pipety wielomiarowe na 5 ml i 1 ml. 6. Strzykawki jednorazowe o pojemności 1 ml. 7. Pipety Pasteura. Odczynniki 1. Bufor boranowy (c = 20 mM, pH 9,2) z dodatkiem SDS (30 mM). 2. Podstawowy roztwór wzorcowy kofeiny o stężeniu około 5 mg/ml (dokładne stężenie podane jest na etykiecie butelki). 3. Mieszania metanol/woda % v/v. 4. Roztwory do płukania kapilary: 1M NaOH, woda, metanol.

34

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Wybór i zapisywanie metody

Wybór i zapisywanie sekwencji

Wybór między analizami pojedynczych próbek a analizą serii (sekwencji) próbek

Diagram układu CE

Informacje o próbce i miejscu zapisywania wyników analiz

Widmo w zakresie UV-Vis

Sygnał z DAD lub okno sygnałów pomocniczych

Rys. 5. Widok ekranu głównego programu ChemStation

35

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Dozowanie Sterowanie i temperatura autosamplera

Czas trwania analizy (Stoptime)

Stan aparatu 

Informacje o błędach

Wskaźniki otwarcia pokrywy autosamplera i pokrywy górnej

Detektor DAD   

Ustawianie sygnałów DAD Włączanie/wyłączanie lampy Kalibracja długości fali

Przyciski otwierania/zamykania okien sygnałów z DAD i sygnałów pomocniczych

Układ automatycznej wymiany buforu    

Wymiana buforu we fiolce Napełnienie fiolki Opróżnianie fiolki Płukanie rurek układu

Kompresor  

Przepłukiwanie kapilary Przykładanie ciśnienia

Fiolki wylotowa i wlotowa Zasilacz wysokonapięciowy

Kaseta z kapilarą  



Nastawianie temperatury Wybór kapilary Wymiana kasety

Nastawianie parametrów prądu

Rys. 6. Elementy układu do elektroforezy kapilarnej

36

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Uruchomienie aparatu CE i wykonanie analiz 1. W tym celu włączyć aparat (włącznik znajduje się w lewym dolnym rogu przedniej ścianki aparatu). Włączyć komputer i uruchomić program ChemStation online, którego ikona znajduje się na pulpicie. Przygotować polipropylenowe fiolki do CE, odmierzyć do nich wymienione niżej roztwory, zamknąć je poliuretanowymi kapslami i umieścić w odpowiednich pozycjach automatycznego podajnika próbek:  Pozycja 1 – fiolka z buforem wlotowa: 0,4 ml buforu separacyjnego;  Pozycja 2 – fiolka z buforem wylotowa: 0,4 ml buforu separacyjnego;  Pozycja 3 – fiolka z buforem do przepłukiwania: 0,4 ml buforu separacyjnego;  Pozycja 43 – fiolka na zlewki: pozostawić pustą;  Pozycja 44 – roztwór do płukania: 0,4 ml 1M NaOH;  Pozycja 45 – woda do płukania: 0,4 ml wody dejonizowanej  Pozycja 46 - metanol do płukania; Po uruchomieniu programu przejść do menu InstrumentSystem INIT (Rys. 7). Po uruchomieniu tej funkcji aparat dokona sprawdzenia poprawności działania podzespołów oraz uruchomi lampę detektora. Rys. 7.

W okienku Methods sprawdzić czy jest załadowana metoda KOFEINA.M. Jeśli nie, wybrać ją z menu rozwijalnego, w którym zachowane są ostatnio używane metody (Rys. 8). Rys. 8.

37

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Sprawdzić poprawność najważniejszych parametrów metody KOFEINA.M. W tym celu w menu Instrument sprawdzić po kolei nastepujace ustawienia:  CE Homevalues (ustawienia podstawowe): Offset 4 mm, Temperature 30°C, Vials: Inlet Home 1, Outlet Home 2.  CE Conditioning (kondycjonowanie kapilary): Replenishment and Conditioning should be processed: parallel; Replenish: none; Postconditioning: none, Preconditioning: Use Table (nacisnąć Edit i sprawdzić: funkcja Flush, 2 min, Inlet 3, Outlet 43).  CE Injection (dozowanie): Inject by: Pressure, 10 mbar, 10 s (100 mbar·s).  CE Electric (ustawienia parametrów prądu): Switch Electric: on; Polarity: positive; Power: Syslimit, Voltage: 0 kV; Current 100 A. Ustawienie napięcia 0 kV w tym miejscu jest konieczne, aby móc ustawić narost napięcia w Timetable (patrz niżej).  CE Timetable (ustawienia czasu zmiany wszelkich parametrów podczas analizy): Zaznaczamy zapamiętywanie (Store data) wartości napięcia (Voltage) i natężenia prądu (Current). Zapamiętanie przebiegów napięcia i natężenia prądu podczas analizy może być pomocne przy interpretacji ewentualnych błędów (np. spadek czy gwałtowny wzrost natężenia). Czas analizy: Stoptime 15 min. Czas 15 min zaznaczamy w przypadku analizowania próbek. Podczas dozowania roztworów wzorcowych czas ten można skrócić do 6-7 minut. W tabeli Time Table ustawiamy czas 0.5 min i napięcie 20 kV (patrz Rys. 9). W ten sposób napięcie nie będzie przykładane skokowo, ale stopniowo wzrośnie (w ciągu 0,5 min) do żądanej wartości (20 kV). Rys. 9.



Set up DAD Signals (ustawienia detektora DAD): zaznaczyć zapamiętywanie sygnału (Store) zbieranego przy długości fali 210 nm. Pozostawić długość 210 nm na kanale B detektora DAD. Żądana długość fali może być ustawiona w zasadzie na każdym z kanałów, należy jednak pamiętać, że musi być zgodność między zaznaczonym i zapamiętywanym a sygnałem ustawieniami Signal Details w menu Calibration. Ustawienia detektora DAD można zostawić tak jak jest to pokazane na Rys. 10.

38

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Rys. 10.

Ekran główny programu ChemStation podzielony jest na kilka części/okien (Rys. 5). Do wymienionych wyżej części menu można również dostać się klikając na wybrany element układu CE przedstawiony w centralnej części ekranu (Rys. 6). Kliknięcie spowoduje otwarcie menu dotyczącego danego elementu i możliwość zmiany niektórych parametrów. Gotowy do pracy aparat wyświetla podświetloną na zielono informację Ready w okienku CE-State. Po umieszczeniu wymienionych wyżej fiolek w karuzeli i kasety z kapilarą w aparacie (ze względu na możliwość uszkodzenia kapilary tę czynność wykonuje prowadzący pracownię!) należy przepłukać kapilarę kolejno 1M NaOH 5 min, wodą 5 min, buforem separacyjnym 5 min stosując fiolkę 43 (WASTE) jako fiolkę wylotową. W tym celu należy wskaźnikiem myszy kliknąć na ikonę fiolki (Inlet vial) - Rys. 11. Z rozwiniętego menu wybrać pozycję Set new vial, po czym w okienku Enter vial (1…48) wpisać właściwy numer fiolki lub wybrać fiokę z menu rozwijalnego (Rys. 12). Analogicznie postępować ustawiając fiolkę nr 43 jako wylotową (Outlet vial). Uruchomić płukanie kapilary – kliknąć na ikonę kompresora, wybrać z menu funkcję Flush capillary (Rys. 13) i wpisać czas płukania (Enter time (0…10000)) - 5 min (Rys. 14). Postępując w opisany sposób przepłukać kapilarę kolejno 1M NaOH (fiolka 44), wodą (fiolka 45) i buforem separacyjnym (fiolka 3). Rys. 11.

39

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Rys. 12.

Rys. 13.

40

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Rys. 14.

Po tych czynnościach aparat jest gotowy do wykonywania analiz. 2. Przygotowanie krzywej wzorcowej. Z podstawowego roztworu wzorcowego kofeiny sporządzić (w kolbkach miarowych na 10 ml) roztwory robocze o stężeniach 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 mg/ml poprzez odmierzenie pipetą odpowiedniej objętości roztworu stężonego i dopełnienie wodą do kreski w kolbce miarowej. Roztwory dokładnie wymieszać i przenieść ok. 0,3 ml każdego z nich do kolejnych opisanych fiolek polipropylenowych do CE. Fiolki te ustawić w pozycjach od 10 do 15 w automatycznym podajniku próbek (autosamplerze). W oknie Sample Info (informacje o próbce - Rys. 5) kliknąć na ikonę fiolki. Po otwarciu okna (Rys. 15.) wybrać numer fiolki, w której znajduje się roztwór wzorcowy o najmniejszym stężeniu. W polu Sample name można wpisać nazwę próbki (np. wzorzec 1, wz. 0,01 mg/ml, itp.), natomiast w polu Comment można szerzej opisać próbkę i warunki danej analizy, np. opis buforu, parametrów analizy, itd. W polu Data File i Path (ścieżka zapisu danych analizy) sprawdzić, czy dane będą zapisywane w domyślnym katalogu C:\CHEM32\1\DATA\. Nazwę docelowego podkatalogu można wybrać w sposób dowolny (np. COSMETICS). Nazwa pliku składa się z oznaczenia początkowego (Prefix) i numeracji (Counter). Numery plików zwiększają się automatyczne wraz z wykonywaniem kolejnych analiz.

Rys. 15.

41

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

3. Po ustaleniu parametrów można nacisnąć przycisk Start, aby rozpocząć analizę. Rozdzielanie zakończy się po ustalonym czasie. Czas końca analizy można zmieniać podczas jej trwania (przedłużać bądź skracać) klikając na ikonę zegara (Stoptime). Naciskając przycisk Stop można zakończyć analizę w dowolnym momencie z zachowaniem uzyskanych danych, natomiast wybierając funkcję Abort (patrz górne Menu, Rys. 5) przerywamy analizę bez zachowania danych. 4. Aby przeglądać uzyskane wyniki należy otworzyć program ChemStation (off-line), którego ikona znajduje się na pulpicie. W menu File wybrać Load Signal, zaznaczyć właściwy plik (okienko File name) oraz wybrać sygnał z detektora DAD (okienko Signals). Ta ostatnia czynność zapobiega załadowaniu pozostałych zapamiętanych danych (zapis napięcia i natężenia prądu) (Rys. 16). Po otwarciu elektroferogram powinien zostać automatycznie zintegrowany (Rys. 17). Rys. 16.

Rys. 17.

42

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

5. W prawym dolnym okienku wyświetlają się podstawowe parametry pików, w tym przybliżone wartości wysokości i pól powierzchni. Wartości dokładne można uzyskać wyświetlając raport z wykonanej analizy (Menu: Report-Print report). Na stronie drugiej raportu przedstawiona jest tabela zawierająca szukane wartości pól powierzchni pików, natomiast na stronie trzeciej i kolejnych przedstawione są widma UV-Vis (w zadanym wcześniej zakresie długości fali, czyli zazwyczaj 190-600 nm) poszczególnych zintegrowanych pików. Widma te mogą być pomocne przy identyfikacji rozdzielanych analitów. Z raportu wynotować (jeśli nie ma możliwości wydruku raportu) pola powierzchni analizowanych związków. 6. Dozować kolejne roztwory wzorcowe poczynając od tego o najniższym stężeniu. Wynotować czasy migracji i pola powierzchni piku kofeiny. Z uzyskanych danych sporządzić (np. w programie MS Excel) krzywą wzorcową zależności pola powierzchni piku od stężenia roztworu wzorcowego, S = f(c), znaleźć równanie krzywej. Widmo UV-Vis kofeiny przedstawione na Rys. 18 może być pomocne w identyfikacji tego analitu. Aby podejrzeć widmo piku należy wybrać przycisk Spectrum i nacisnąć Select spectrum at peak apex position. Najechać na pik i kliknąć. Rys. 18.

7. Analiza próbki. Podczas analizowania roztworów wzorcowych przygotować próbkę do analizy. W tym celu bezpośrednio do kolb miarowych na 50 ml odważyć po ok. 1 g szamponu do włosów i toniku zawierających kofeinę. Ze względu na wysoką lepkość tych produktów można je wygodnie nabierać strzykawką plastikową o pojemności 1 ml. Do każdej z kolb dodać 0,5 ml metanolu, ok. 40 ml wody i delikatnie wymieszać. Po rozpuszczeniu próbek uzupełnić do kreski wodą. Do fiolek do CE przenieść ok. 0,3 ml tak przygotowanych próbek i poddać je analizie w warunkach takich, jak analizowano roztwory wzorcowe. 8. Na podstawie równania krzywej wzorcowej obliczyć zawartość kofeiny w badanych kosmetykach. 𝑋[%] =

𝑐[

𝑚𝑔 𝑚𝑙

] × 𝑉[𝑚𝑙]

𝑚𝑝𝑟ó𝑏𝑘𝑖 [𝑔] × 1000

× 100%

()

gdzie: c – stężenie kofeiny odczytane z krzywej wzorcowej; V – objętość roztworu próbki; mpróbki – masa próbki; 1000 – współczynnik przeliczeniowy 1000 mg/g. 43

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki Porównać obliczoną zawartość z typowymi zawartościami kofeiny w kosmetykach. Literatura 1. B. Buszewskiego, E. Dziubakiewicz i M. Szumskiego (praca zbiorowa pod red.) Techniki elektromigracyjne – teoria i praktyka, Wydawnictwo Malamut, Warszawa 2012. 2. A. Herman, A.P. Herman, Caffeine’s mechanism of action and its cosmetic use, Skin Pharmacol. Physiol. 26 (2013) 8-14.

44

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 6 OZNACZANIE PARABENÓW W WYBRANYCH KOSMETYKACH ZA POMOCĄ TECHNIK ELEKTROMIGRACYJNYCH Wstęp Parabeny to wspólna nazwa dla niektórych estrów kwasu 4-hydroksybenzoesowego stosowanych jako środki konserwujące w kosmetykach. Najczęściej wykorzystywane są metylo-, etylo-, propylo- i butyloparaben. OH

O

O

R

Rys. 1 Wzór strukturalny parabenów. R = -CH3, -C2H5, -C3H7, -C4H9.

Dodatek parabenów zapobiega rozwojowi mikroorganizmów (bakterii i grzybów) w rozmaitych kosmetykach, co przekłada się na długi okres ich przydatności do użycia i bezpieczeństwo stosowania. Parabeny można spotkać w takich produktach, jak dezodoranty, kremy, balsamy nawilżające, szampony do włosów, żele do golenia czy pasty do zębów. Stosowane są od lat 50 XX wieku i ich działanie potencjalnie alergizujące i powodujące zapalenie skóry jest znane, jednak od lat 90 zaczęto mówić o innych niebezpiecznych właściwościach, jak na przykład aktywności estrogenowej (szczególnie butyloparaben). Obecnie odchodzi się od stosowania parabenów, są one jednak wciąż obecne w wielu kosmetykach. Dopuszczalna zawartość pojedynczego parabenu w produkcie kosmetycznym wynosi 0.4% wag, natomiast całkowita zawartość tych substancji nie może przekroczyć 0.8% wag. Zawartość parabenów w kosmetykach oznaczana jest zazwyczaj za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, z tym że konieczne jest wcześniejsze wyizolowanie tego analitu z próbki albo pozbycie się wielu substancji przeszkadzających. Alternatywą może być zastosowanie elektroforezy kapilarnej (CE) lub micelarnej chromatografii elektrokinetycznej (MEKC – micellar electrokinetic chromatography), przy których to technikach przygotowanie próbki może być niekiedy znacząco uproszczone. Elektroforeza kapilarna to technika rozdzielania substancji obdarzonych ładunkiem w fazie ciekłej. Podstawą rozdzielania jest wykorzystanie różnic w prędkości migracji analizowanych indywiduów w polu elektrycznym. Rozdzielanie przeprowadza się w kapilarze o średnicy wewnętrznej zawierającej się w granicach 25-100 µm i długości od ok. 30 cm do ok. 100 cm. Kapilara wypełniona jest buforem separacyjnym o odpowiednim dla danego zadania analitycznego składzie, pH i stężeniu (sile jonowej) oraz w razie potrzeby zawierającego rozmaite dodatki. Umieszczone w kapilarze jonowe składniki próbki migrują w polu elektrycznym z prędkościami zależnymi od ich własnej ruchliwości elektroforetycznej (µEP) oraz przyłożonego pola elektrycznego (E): 𝑣𝐸𝑃 = 𝜇𝐸𝑃 𝐸

(1)

przy czym ruchliwość elektroforetyczna zależy od ładunku jonu (q) oraz jego wielkości (r): 45

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki 𝜇𝐸𝑃 =

𝑞 6𝜋𝑟

(2)

W związku z tym, że podczas danej separacji rozdzielane jony poruszają się w tym samym ośrodku (o lepkości ) i są pod wpływem tego samego pola E, ich szybkości migracji będą zależeć od stosunku ich ładunku do wielkości q/r. Wynika z tego, że najszybciej poruszają się jony małe o dużym ładunku, a najwolniej jony duże o ładunku małym. Substancje nieobdarzone ładunkiem (q=0) pozostają nierozdzielone. Rozdzielanie w warunkach elektroforezy kapilarnej przeprowadza się zazwyczaj w kapilarach kwarcowych. Ze względu na właściwości materiału w kapilarach obserwuje się zjawisko przepływu elektroosmotycznego (EOF – Electroosmotic Flow), który, biorąc pod uwagę jego znaczną prędkość, nie może być zaniedbany podczas rozdzielania. Przepływ elektroosmotyczny to objętościowy przepływ cieczy w strukturach kapilarnych (kapilarach, kanałach, ośrodkach porowatych) powstający pod wpływem różnicy potencjałów. Jego istnienie związane jest z tworzeniem podwójnej warstwy elektrycznej. Jest to konsekwencją zdolności grup silanolowych do dysocjacji (Si-OH  Si-O- + H+), co powoduje, że od pH ok. 2.3 i powyżej kapilara zyskuje coraz większy ładunek ujemny. Kationy buforu przyciągane są do ścianki kapilary siłami elektrostatycznymi i tworzą nieruchomą, silnie związana warstwę Sterna. Nie kompensują one jednak w całości ładunku ścianki kapilary przez co może tworzyć się druga warstwa słabiej związana, nazywana warstwą dyfuzyjną. Jony tej warstwy biorą udział w zjawiskach elektrokinetycznych. Utworzona różnica potencjałów - miedzy związaną z powierzchnią warstwą jonów a głębią roztworu - nazywana jest potencjałem zeta (). Jest on proporcjonalny do gęstości ładunku na wewnętrznej powierzchni kapilary, co bezpośrednio związane jest z pH buforu wypełniającego kapilarę. Od wielkości potencjału zeta zależy prędkość przepływu elektroosmotycznego (vEOF): 𝑣𝐸𝑂𝐹 =

𝜀𝐸 . 4𝜋

(3)

Na EOF największy wpływ mają: pH, siła jonowa buforu, lepkość, dodatki w postaci rozpuszczalników organicznych, środków powierzchniowo czynnych, polimerów obojętnych elektrycznie lub jonowych oraz chemiczne modyfikacje wewnętrznej powierzchni kapilary. EOF można obserwować w strukturach kapilarnych innych materiałów, nawet takich które uważane są za chemicznie obojętne, np. w kapilarach teflonowych. Za utworzenie podwójnej warstwy elektrycznej odpowiedzialna jest adsorpcja składników buforu na powierzchni takiej kapilary. EOF 

+





--











































+

-

-























+



















++

+













Rys. 1. Rzeczywista a obserwowana ruchliwość elektroforetyczna.

46

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

EOF 

















obs =EOFEP EOF (-)

+

EP





-

(-)



































(-)





obs =EOF













+











obs =EP +EOF EOF (+) EP (+)

(0)









(+)









Rys. 2. Kolejność migracji jonów podczas rozdzielania elektroforetycznego Prędkość przepływu elektroosmotycznego w kapilarach kwarcowych przy pH ok. 8-9 jest na tyle duża, że do detektora (umieszczonego przy katodzie) docierają także aniony o względnie dużej ruchliwości elektroforetycznej. Za pomocą CE, w obecności EOF, można więc rozdzielać podczas jednej analizy kationy i aniony. W takim przypadku mówi się o ruchliwościach obserwowanych (obs) będących wypadkową własnych ruchliwości elektroforetycznych jonów oraz ruchliwości elektroosmotycznej. W warunkach elektroforezy kapilarnej nie można rozdzielić substancji neutralnych, nieobdarzonych ładunkiem – migrują one z prędkością EOF. Rozwiązaniem może być zastosowanie jednej z technik pochodnych – micelarnej chromatografii elektrokinetycznej (MEKC – Micellar Electrokinetic Chromatography). W MEKC do buforu dodaje się środka powierzchniowo czynnego. Cząsteczka środka powierzchniowo czynnego zbudowana jest z długiego, hydrofobowego łańcucha węglowodorowego (lub innej struktury) na którego jednym z końców znajduje się polarna grupa funkcyjna. Dzięki obecności grupy o charakterze polarnym substancje takie są rozpuszczalne w wodzie. Jeśli zostanie przekroczone tzw. krytyczne stężenie micelarne (CMC) cząsteczki środka powierzchniowo czynnego organizują się w struktury zwane micelami. Micele charakteryzujące się kulistym lub elipsoidalnym kształtem zbudowane są z określonej (zazwyczaj) liczby cząsteczek środka powierzchniowo czynnego w ten sposób, że hydrofobowe „ogony” skierowane są do wnętrza miceli, natomiast hydrofilowe „głowy” – na zewnątrz. Liczba cząsteczek środka powierzchniowo czynnego tworzącego micelę nazywana jest liczba agregacji i podobnie jak CMC jest charakterystyczna dla danej substancji. Micela ma więc hydrofobowe wnętrze, a dzięki hydrofilowej powierzchni jest dobrze rozpuszczalna w wodzie. Anality obojętne mogą wnikać do hydrofobowego wnętrza miceli ulegając w ten sposób podziałowi między fazę wodną (otaczający micelę bufor) a fazę niepolarną (wnętrze miceli). Micele pełnią rolę podobną co chemicznie związana hydrofobowa faza stacjonarna w chromatografii cieczowej. Z tego względu w MEKC micele zwane są „fazą pseudostacjonarną”. W związku z tym, ze micele posiadają ładunek elektryczny migrują w kierunku detektora z własną ruchliwością wypadkową. W warunkach MEKC możliwe jest rozdzielanie kationów, anionów i substancji neutralnych. Mechanizm rozdzielania jest mieszany: dla niektórych analitów jest czysto elektroforetyczny, dla innych (neutralnych) podziałowy (podobnie jak w chromatografii) a dla jeszcze innych będący wypadkową działania tych dwóch mechanizmów. Na stałą podziału między micele a bufor można wpływać np. dodając do buforu niewielką ilość rozpuszczalnika organicznego, np. metanolu lub acetonitrylu. Ilość ta zazwyczaj nie przekracza kilkukilkunastu procent ze względu na możliwość zniszczenia struktur micelarnych. 47

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Aparatura do elektroforezy kapilarnej jest schematycznie przedstawiona na poniższym rysunku oraz na załączonym niżej schemacie z programu ChemStation.

Rys. 3. Miniaturowe techniki separacyjne, do których należy CE, wymagają stosowania specjalnie zaprojektowanych układów detekcyjnych. Najczęściej stosowanymi detektorami są: spektrofotometryczny UV-Vis, fluorescencyjny, MS i konduktometryczny (kontaktowy i bezkontaktowy). Największy problem z najpopularniejszą detekcją spektrofotometryczna związany jest z krótką drogą optyczną (w przypadku detekcji on-column jest ona równa wewnętrznej średnicy kapilary/kolumny), co w bezpośredni sposób wpływa na czułość. Za najczulszy detektor stosowany w technikach mikroseparacyjnych uważa się detektor z laserowo wzbudzoną fluorescencją (LIF), jednak osiągane tu wysokie czułości są ściśle związane z odpowiednim zaprojektowaniem i jakością układu optycznego. Aby zwiększyć czułość oznaczeń w technikach elektromigracyjnych stosuje się cały szereg tzw. metod zatężania analitów w kapilarze. W metodach tych w rozmaity sposób wykorzystuje się zjawiska elektrokinetyczne w taki sposób, aby zogniskować w wąskiej strefie o wysokim stężeniu anality, które w próbce występują w znacznym rozcieńczeniu.

Rys. 4. Schemat zatężania analitów przez spiętrzanie we wzmocnionym polu elektrycznym [3]. 48

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Najprostszym sposobem uzyskania efektu zatężenia (patrz rysunek powyżej) w elektroforezie kapilarnej jest przygotowanie próbki w czystej wodzie, przez co uzyskuje się roztwór o niskim przewodnictwie. Po wprowadzeniu dużej objętości takiej próbki (znacznie większej niż podczas zwykłego dozowania) i włączeniu napięcia, w strefie próbki powstaje wysokie pole elektryczne (związane z niskim jej przewodnictwem), przez co znajdujące się tam jony ulegają gwałtownemu przyspieszeniu i szybko migrują w kierunku elektrody o przeciwnym znaku. Na powyższym przykładzie kationy migrują w kierunku katody i po dotarciu do granicy strefy próbki spowalniają (niskie pole elektryczne strefy buforu związane z wysokim przewodnictwem) i ulegają w ten sposób zogniskowaniu w wąską strefę na granicy próbka/bufor. Analogicznie, aniony ogniskują się na tylnej strefie próbki. Pomimo prostoty, metoda taka pozwala na zwiększenie czułości od ok. 10 do 10000 razy. Szerzej metody te opisane są w publikacjach przeglądowych oraz podręczniku [1]. Również w micelarnej chromatografii elektrokinetycznej stosuje się kilka metod zatężania analitów, różniących się nieco od tych stosowanych w CE ze względu na brak ładunku rozdzielanych indywiduów. Jedną z metod może być zatężanie przez spiętrzanie z dużą strefą próbki (LVSS), jednak sam mechanizm różni się nieco od analogicznego mechanizmu LVSS stosowanego w CE.

Rys.5. Schemat zatężania parabenów przez spiętrzanie z dużą strefą próbki [2]. Mechanizm zatężania LVSS-MEKC można opisać następująco: W LVSS kierunek migracji elektroforetycznej analitów musi być przeciwny do EOF, tak aby kationy lub aniony zostały zogniskowane w przedniej bądź tylnej części strefy próbki. Podczas etapu rozdzielania prędkość migracji analitów musi być większa od prędkości EOF, co będzie miało tę zaletę, że etap zatężania i rozdzielania będą przebiegać pod tym samym napięciem. W przypadku zatężania i rozdzielania parabenów metodą LVSS-MEKC powstawać mogą połączenia środka powierzchniowo czynnego z parabenami o ładunku ujemnym (SDS to anionowy środek powierzchniowo czynny). Stosując bufor o niskim pH (znaczne zahamowanie EOF) oraz odwróconą polaryzację elektrod (anoda u wyloty kapilary) możliwe będzie spowodowanie efektywnej migracji układów paraben-SDS w kierunku anody, a więc i detektora. Po wprowadzeniu do kapilary dużej objętości próbki o niskim przewodnictwie w kapilarze tworzą się dwie strefy: strefa próbki i strefa buforu separacyjnego. Po włączeniu prądu o odwróconej polaryzacji elektrod (anoda u wylotu) w 49

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

strefie próbki powstaje silne pole elekryczne co powoduje szybką migrację cząsteczek SDS w kierunku anody. Cząsteczki te porywają ze sobą cząsteczki parabenów i migrują aż do osiągnięcia granicy stref, na której ulegają zatężeniu. Jednocześnie, w strefie próbki nie panują warunki niskiego pH, przez co tworzy się tam przepływ elektroosmotyczny skierowany ku wlotowi kapilary (czyli w kierunku katody). Te dwa zjawiska powodują, że anality zostaną zatężone na granicy stref (końcowo – na wlocie do kapilary), a jednocześnie matryca próbki zostanie usunięta z kapilary. Po tym rozpoczyna się rozdzielanie w warunkach MEKC ze spowolnionym EOF. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest oznaczenie zawartości parabenów w wybranych kosmetykach metodą micelarnej chromatografii elektrokinetycznej z zatężaniem próbki metodą LVSS (large-volume sample stacking). Zakres materiału Techniki elektromigracyjne – wiadomości ogólne, elektroforeza kapilarna (CE), micelarna chromatografia elektrokinetyczna (MEKC), ruchliwość elektroforetyczna, przepływ elektroosmotyczny, mechanizm rozdzielania w CE i MEKC, środek powierzchniowo czynny, micela (liczba agregacji, krytyczne stężenie micelarne), budowa aparatu do CE, sposoby detekcji w technikach elektromigracyjnych metody zatężania analitów w kapilarze. Wykonanie ćwiczenie Aparatura i sprzęt laboratoryjny Aparat do elektroforezy kapilarnej Agilent Technologies. Kapilara kwarcowa o średnicy wewnętrznej dc = 50 m ,Ltot = 64.5 cm i długości efektywnej Leff = 56 cm. Kolby miarowe na 25 ml – 10 szt. Fiolki na 20-30 ml – 10 szt. Pipety wielomiarowe na 5 ml i 1 ml. Strzykawki jednorazowe o pojemności 1 ml. Pipety Pasteura. Małe lejki. Sączki filtracyjne. Odczynniki Bufor fosforanowy (c = 50 mM, pH 2,28) z dodatkiem SDS (150 mM). Podstawowy roztwór wzorcowy parabenów w metanolu o stężeniu około 1·10-2 mol/l (dokładne stężenie podane jest na etykiecie butelki). Metanol. Woda dejonizowana. Mieszanina metanol/woda 60/40 (obj.) Roztwory do płukania kapilary: 1M NaOH, woda, metanol.

50

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Wybór i zapisywanie metody

Wybór i zapisywanie sekwencji

Wybór między analizami pojedynczych próbek a analizą serii (sekwencji) próbek

Diagram układu CE

Informacje o próbce i miejscu zapisywania wyników analiz

Widmo w zakresie UV-Vis

Sygnał z DAD lub okno sygnałów pomocniczych

Rys. 6. Widok ekranu głównego programu ChemStation. 51

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Dozowanie Sterowanie i temperatura autosamplera

Czas trwania analizy (Stoptime)

Stan aparatu 

Informacje o błędach

Wskaźniki otwarcia pokrywy autosamplera i pokrywy górnej

Detektor DAD   

Ustawianie sygnałów DAD Włączanie/wyłączanie lampy Kalibracja długości fali

Przyciski otwierania/zamykania okien sygnałów z DAD i sygnałów pomocniczych

Układ automatycznej wymiany buforu    

Wymiana buforu we fiolce Napełnienie fiolki Opróżnianie fiolki Płukanie rurek układu

Kompresor  

Fiolki wylotowa i wlotowa

Przepłukiwanie kapilary Przykładanie ciśnienia

Zasilacz wysokonapięciowy

Kaseta z kapilarą   

Nastawianie temperatury Wybór kapilary Wymiana kasety

Nastawianie parametrów prądu

Rys. 7. Elementy układu do elektroforezy kapilarnej.

52

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Wykonanie 9. Przygotować aparat CE do wykonywania analiz. W tym celu włączyć aparat (włącznik znajduje się w lewym dolnym rogu przedniej ścianki aparatu). Włączyć komputer i uruchomić program ChemStation (online), którego ikona znajduje się na pulpicie. Przygotować polipropylenowe fiolki do CE, odmierzyć do nich wymienione niżej roztwory, zamknąć je poliuretanowymi kapslami i umieścić w odpowiednich pozycjach automatycznego podajnika próbek:  Pozycja 1 – fiolka z buforem wlotowa: 0,4 ml buforu separacyjnego;  Pozycja 2 – fiolka z buforem wylotowa: 0,4 ml buforu separacyjnego;  Pozycja 3 – fiolka z buforem do przepłukiwania: 0,4 ml buforu separacyjnego;  Pozycja 43 – fiolka na zlewki: pozostawić pustą;  Pozycja 44 – roztwór do płukania: 0,4 ml 1M NaOH;  Pozycja 45 – woda do płukania: 0,4 ml wody dejonizowanej  Pozycja 46 - metanol do płukania; Po uruchomieniu programu przejść do menu InstrumentSystem INIT (Rys. 8). Po uruchomieniu tej funkcji aparat dokona sprawdzenia poprawności działania podzespołów oraz uruchomi lampę detektora. Rys. 8.

W okienku Methods sprawdzić czy jest załadowana metoda PARABENS.M. Jeśli nie, wybrać ją z menu rozwijalnego, w którym zachowane są ostatnio używane metody (Rys. 9.).

53

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Rys. 9.

Sprawdzić poprawność najważniejszych parametrów metody PARABENS.M. W tym celu w menu Instrument sprawdzić po kolei nastepujace ustawienia:  CE Homevalues (ustawienia podstawowe): Offset 4 mm, Temperature 25°C, Vials: Inlet Home 1, Outlet Home 2.  CE Conditioning (kondycjonowanie kapilary): Replenishment and Conditioning should be processed: parallel; Replenish: none; Postconditioning: none, Preconditioning: Use Table (nacisnąć Edit i sprawdzić: 1. funkcja Flush, 2 min, Inlet 44, Outlet 43, 2. funkcja Flush, 1 min, Inlet 46, Outlet 43, 3. funkcja Flush, 2 min, Inlet 45, Outlet 43, 4. funkcja Flush, 2 min, Inlet 3, Outlet 43 ).  CE Injection (dozowanie): Inject by: Pressure, 50 mbar, 30 s (1500 mbar·s)  CE Electric (ustawienia parametrów prądu): Switch Electric: on; Polarity: negative; Power: Syslimit, Voltage: 0 kV; Current 100 A. Ustawienie napięcia 0 kV w tym miejscu jest konieczne, aby móc ustawić narost napięcia w Timetable (patrz niżej).  CE Timetable (ustawienia czasu zmiany wszelkich parametrów podczas analizy): Zaznaczamy zapamiętywanie (Store data) wartości napięcia (Voltage) i natężenia prądu (Current). Zapamiętanie przebiegów napięcia i natężenia prądu podczas analizy może być pomocne przy interpretacji ewentualnych błędów (np. spadek czy gwałtowny wzrost natężenia). Czas analizy: Stoptime 15 min. Czas 15 min zaznaczamy w przypadku analizowania próbek. Podczas dozowania roztworów wzorcowych czas ten można skrócić do 10 minut. W tabeli Time Table ustawiamy czas 0.5 min i napięcie 20 kV (patrz Rys. 10). W ten sposób napięcie nie będzie przykładane skokowo, ale stopniowo wzrośnie (w ciągu 0,5 min) do żądanej wartości (20 kV).

54

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Rys. 10.



Set up DAD Signals (ustawienia detektora DAD): zaznaczyć zapamiętywanie sygnału (Store) zbieranego przy długości fali 210 nm. Pozostawić długość 210 nm na kanale B detektora DAD. Żądana długość fali może być ustawiona w zasadzie na każdym z kanałów, należy jednak pamiętać, że musi być zgodność między zaznaczonym i zapamiętywanym sygnałema ustawieniami Signal Details w menu Calibration. Ustawienia detektora DAD można zostawić tak jak jest to pokazane na Rys. 6.

Rys. 11.

55

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Ekran główny programu ChemStation podzielony jest na kilka części/okien (Rys. 6). Do wymienionych wyżej części menu można również dostać się klikając na wybrany element układu CE przedstawiony w centralnej części ekranu (Rys. 7). Kliknięcie spowoduje otwarcie menu dotyczącego danego elementu i możliwość zmiany niektórych parametrów. Gotowy do pracy aparat wyświetla podświetloną na zielono informację Ready w okienku CE-State. Po umieszczeniu wymienionych wyżej fiolek w karuzeli i kasety z kapilarą w aparacie (ze względu na możliwość uszkodzenia kapilary tę czynność wykonuje prowadzący pracownię!) należy przepłukać kapilarę kolejno 1M NaOH 5 min, wodą 5 min, buforem separacyjnym 5 min stosując fiolkę 43 (WASTE) jako fiolkę wylotową. W tym celu należy wskaźnikiem myszy kliknąć na ikonę fiolki (Inlet vial) - Rys. 12. Z rozwiniętego menu wybrać pozycję Set new vial, po czym w okienku Enter vial (1…48) wpisać właściwy numer fiolki lub wybrać fiokę z menu rozwijalnego (Rys. 13). Analogicznie postępować ustawiając fiolkę nr 43 jako wylotową (Outlet vial). Uruchomić płukanie kapilary – kliknąć na ikonę kompresora, wybrać z menu funkcję Flush capillary (Rys. 14) i wpisać czas płukania (Enter time (0…10000)) - 5 min (Rys. 15). Postępując w opisany sposób przepłukać kapilarę kolejno 1M NaOH (fiolka 44), wodą (fiolka 45) i buforem separacyjnym (fiolka 3). Rys. 12.

Rys. 13.

56

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki Rys. 14.

Rys. 15

Po tych czynnościach aparat jest gotowy do wykonywania analiz. 10. Przygotowanie krzywej wzorcowej. Z podstawowego roztworu wzorcowego parabenów sporządzić roztwór roboczy pośredni o stężeniu 1·10-4 w 60/40 metanol/woda, a z niego (w kolbkach miarowych na 25 ml) roztwory robocze o stężeniach 1·10-6, 2·10-6, 5·10-6, 8·10-6, 1·10-5, 2·10-5 mol/l poprzez odmierzenie pipetą odpowiedniej objętości roztworu pośredniego i dopełnienie wodą do kreski w kolbce 57

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

miarowej. Roztwory dokładnie wymieszać i przenieść ok. 0,3 ml każdego z nich do kolejnych opisanych fiolek polipropylenowych do CE. Fiolki te ustawić w pozycjach od 10 do 15 w automatycznym podajniku próbek (autosamplerze). W oknie Sample Info (informacje o próbce - Rys. 6) kliknąć na ikonę fiolki. Po otwarciu okna (Rys. 16.) wybrać numer fiolki, w której znajduje się roztwór wzorcowy o najmniejszym stężeniu. W polu Sample name można wpisać nazwę próbki (np. wzorzec 1, itp.), natomiast w polu Comment można szerzej opisać próbkę i warunki danej analizy, np. opis buforu, parametrów analizy, itd. W polu Data File i Path (ścieżka zapisu danych analizy) sprawdzić, czy dane będą zapisywane w domyślnym katalogu C:\CHEM32\1\DATA\. Nazwę docelowego podkatalogu można wybrać w sposób dowolny (np. PARABENS). Nazwa pliku składa się z oznaczenia początkowego (Prefix) i numeracji (Counter). Numery plików zwiększają się automatyczne wraz z wykonywaniem kolejnych analiz. Rys. 16.

11. Po ustaleniu parametrów można nacisnąć przycisk Start, aby rozpocząć analizę. Rozdzielanie zakończy się po ustalonym czasie. Czas końca analizy można zmieniać podczas jej trwania (przedłużać bądź skracać) klikając na ikonę zegara (Stoptime). Naciskając przycisk Stop można zakończyć analizę w dowolnym momencie z zachowaniem uzyskanych danych, natomiast wybierając funkcję Abort (patrz górne Menu, Rys. 6) przerywamy analizę bez zachowania danych. 12. Aby przeglądać uzyskane wyniki należy otworzyć program ChemStation (off-line), którego ikona znajduje się na pulpicie. W menu File wybrać Load Signal, zaznaczyć właściwy plik (okienko File name) oraz wybrać sygnał z detektora DAD (okienko Signals). Ta ostatnia czynność zapobiega załadowaniu pozostałych zapamiętanych danych (zapis napięcia i natężenia prądu) (Rys. 17). Po otwarciu elektroferogram powinien zostać automatycznie zintegrowany (Rys. 18).

58

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki Rys. 17.

Rys. 18.

13. W prawym dolnym okienku wyświetlają się podstawowe parametry pików, w tym przybliżone wartości wysokości i pól powierzchni. Wartości dokładne można uzyskać wyświetlając raport z wykonanej analizy (Menu: Report-Print report). Na stronie drugiej raportu przedstawiona jest tabela zawierająca szukane wartości pól powierzchni pików, natomiast na stronie trzeciej i kolejnych przedstawione są widma UV-Vis (w zadanym wcześniej zakresie długości fali, czyli zazwyczaj 190-600 nm) 59

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

poszczególnych zintegrowanych pików. Widma te mogą być pomocne przy identyfikacji rozdzielanych analitów. Z raportu wynotować (jeśli nie ma możliwości wydruku raportu) pola powierzchni analizowanych związków. 14. Dozować kolejne roztwory wzorcowe poczynając od tego o najniższym stężeniu. Wynotować czasy migracji i pola powierzchni pików parabenów. Z uzyskanych danych sporządzić (np. w programie MS Excel) krzywą wzorcową zależności pola powierzchni piku od stężenia roztworu wzorcowego, S = f(c), znaleźć równanie krzywej. Widmo UV-Vis butyloparabenu przedstawione na Rys. 19 może być pomocne w identyfikacji tego analitu. Aby podejrzeć widmo piku należy wybrać przycisk Spectrum i nacisnąć Select spectrum at peak apex position. Najechać na pik i kliknąć. Rys. 19.

15. Analiza próbki. Podczas analizowania roztworów wzorcowych przygotować próbkę (próbki) do analizy. W tym celu w falkonach na 15 ml odważyć po ok. 1 g kremu zawierającego parabeny. Dodać 5 ml metanolu i wytrząsać kilka minut. Ekstrakt przesączyć do kolbki miarowej na 25 ml. Ekstrakcję powtórzyć jeszcze 2 razy. Połączone ekstrakty metanolowe uzupełnić metanolem do kreski. Pobrać 0,25 ml roztworu i rozcieńczyć go wodą w kolejnej kolbce miarowej na 25 ml. Do fiolek do CE przenieść ok. 0,3 ml tak przygotowanych rozcieńczonych ekstraktów i poddać je analizie w warunkach takich, jak analizowano roztwory wzorcowe. 16. Na podstawie równań krzywych wzorcowych obliczyć zawartość parabenów w badanych kosmetykach. 𝑚𝑜𝑙

𝑋[%] =

𝑐[

𝑙

] × 𝑉[𝑚𝑙] × 100 × 𝑀𝑊

𝑚𝑝𝑟ó𝑏𝑘𝑖 [𝑔] × 1000

× 100%

(1)

gdzie: c – stężenie parabenu odczytane z krzywej wzorcowej; V – objętość roztworu próbki; 60

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

MW – masa molowa parabenu (MMP = 152,15; MEP = 166,17; MPP = 180,20; MBP = 194,23 g/mol) mpróbki – masa próbki [g]; 100 – rozcieńczenie roztworu wodnego w stosunku do ekstraktu metanolowego (0,25 ml25ml); 1000 – współczynnik przeliczeniowy 1000 ml/l. Porównać kosmetykach.

obliczoną

zawartość

z

dopuszczalną

zawartością

parabenów

w

Literatura 1. Techniki elektromigracyjne – teoria i praktyka, praca zbiorowa pod red. B. Buszewskiego, E. Dziubakiewicz i M. Szumskiego, Wydawnictwo Malamut, Warszawa 2012. 2. Comparative study for the analysis of parabens by micellar electrokinetic capillary chromatography with and without large-volume sample stacking, S. He et al., Talanta 69 (2006) 166-171. 3. Oznaczanie witamin rozpuszczalnych w wodzie za pomocą elektroforezy kapilarnej, M. Brzozowska, praca licencjacka, UMK, 2015.

61

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 7 ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ W OZNACZANIU KWASÓW KARBOKSYLOWYCH W PRODUKTACH KOSMETYCZNYCH Wstęp Wśród technik analitycznych pozwalających śledzić efekt rozdzielenia składników występujących w mieszaninach o skomplikowanym składzie wyróżnić należy chromatografię cieczową. Technika ta umożliwia śledzenie procesu adsorpcji składników w układach ciało stałe–ciecz. Jednym z wariantów chromatografii cieczowej jest chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin layer chromatography - TLC), umożliwiająca wykonanie szybkiej analizy, nawet kilkunastu mieszanin, w tym samym czasie. We wspomnianej technice faza stacjonarna naniesiona jest na płytkę szklaną, folię aluminiową lub tworzywo sztuczne. Natomiast faza ruchoma dostarczana jest z dozownika komory chromatograficznej. W trakcie procesu chromatograficznego badana substancja dzieli się pomiędzy dwie fazy – ruchomą i nieruchomą. W adsorpcyjnej chromatografii cieczowej fazą nieruchomą jest adsorbent, fazą ruchomą eluent jedno- lub wieloskładnikowy, a retencja substancji jest wynikiem różnego powinowactwa cząsteczek badanej substancji do miejsc aktywnych adsorbentu. Różnice w powinowactwie adsorpcyjnym (selektywna adsorpcja) są wynikiem różnej budowy i właściwości chemicznych substancji. Substancje wykazujące większe powinowactwo adsorpcyjne do danego adsorbentu są zatrzymywane przez adsorbent, zaś substancje o ograniczonym powinowactwie do adsorbentu, szybciej poruszają się wzdłuż złoża adsorbentu. Miarą podziału substancji pomiędzy dwie fazy jest współczynnik retencji k definiowany poniższą zależnością: (1) Parametr k w danej temperaturze i w danym układzie chromatograficznym, przyjmuje wartość liczbową charakterystyczną dla analizowanej substancji. Zależy ona od rodzaju oznaczanej substancji (charakter chemiczny i wielkość cząsteczki oraz rodzaj, ilość i rozmieszczenie grup funkcyjnych). W chromatografii cienkowarstwowej parametrem retencyjnym (współczynnik opóźnienia, z ang. retardation factor), wyznaczanym wprost z chromatogramu, jest wielkość RF wyrażana jako:

(2)

62

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Współczynnik retencji k związany jest z wielkością RF następująco: 1 − 𝑅𝐹 𝑘= 𝑅𝐹 lub 1 − 𝑅𝐹 𝑙𝑜𝑔𝑘 = log = 𝑅𝑀 𝑅𝐹

(3)

(4)

W zależności od układu chromatograficznego wartość RF substancji może osiągać wartość 0 ≤ RF ≤1. Substancja bardzo silnie adsorbująca się w danym układzie osiąga wartość RF = 0 (zostaje na linii startu ). Gdy adsorpcja danej substancji jest minimalna i wędruje ona z czołem fazy ruchomej, wówczas RF = 1. Wybrane warianty chromatografii cieczowej Chromatografia bibułowa, należy do metod stosowanych w analizie biochemicznej do wykrywania, rozdzielania oraz oznaczania aminokwasów, peptydów, białek, kwasów nukleinowych, cukrów i innych substancji w płynach ustrojowych. Metoda ta jest prosta i wygodna, ze względu na stosowanie odpowiedniego podłoża, w postaci specjalnie przygotowanej bibuły. Chromatografia bibułowa jest obecnie rzadko stosowana. Natomiast chromatografię TLC można zastosować do wyodrębnienia pojedynczego składnika z mieszaniny i uzyskania go w ilości pozwalającej na wykonanie innych szczegółowych badań analitycznych. Pomocnymi stają się tu densytometria oraz skanowanie chromatogramów TLC, ponieważ pozwalają one na ilościowe oznaczenie rozdzielonych substancji z dużą czułością i dokładnością. Stale ulepszana konstrukcja densytometrów pozwala na przeprowadzenie pomiarów ilościowych w skali nanogramowej. TLC stosuje się często w tzw. analizie przesiewowej (farmaceutycznej, biomedycznej, toksykologicznej), która pozwala na wykrycie określonych składników próbki i poddanie jej dalszej analizie bardziej dokładnymi i precyzyjnymi metodami w przypadku pozytywnego wyniku pierwszy etapie.

W typowym układzie chromatograficznym fazą nieruchomą jest żel krzemionkowy. Przykładem może być płytka szklana, na którą nałożono cienką warstwę (grubość 250 m) żelu krzemionkowego i poddano rozdzieleniu mieszaninę składającą się z benzenu i aminobenzenu, stosując jako fazę ruchomą – aceton (Rys. 1).

Rys. 1. Oddziaływanie mieszaniny benzenu i aminobenzenu z adsorbentem, wobec acetonu jako faza ruchoma. Rozdzielenie mieszaniny na płytce szklanej pokrytej żelem krzemionkowym. Efekt rozdzielenia wymienionej mieszaniny jest wynikiem zachodzących procesów adsorpcji i desorpcji, z tym że aminobenzen adsorbuje się silnie, natomiast benzen adsorbuje się słabo. Cząsteczki 63

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki aminobenzenu i benzenu mogą ulegać desorpcji pod wpływem acetonu, który jest tu używany jako faza ruchoma. W konsekwencji badana substancja - aminobenzen, przebywa niewielki dystans, a dystans przebyty przez benzen jest dłuższy. W jednym i drugim przypadku desorpcję aminobenzenu i benzenu powodują cząsteczki acetonu, które występują w nadmiarze w fazie ruchomej w stosunku do stężenia substancji rozdzielanych. Procesy odnoszące się do chromatografii adsorpcyjnej, można rozpatrywać jako konkurowanie o możliwość zaadsorbowania się na centrach adsorpcji fazy stacjonarnej, zarówno cząsteczek substancji rozdzielanych, jak i fazy ruchomej. Jeżeli cząsteczki substancji rozdzielanych różnią się między sobą budową oraz rodzajem i liczbą grup funkcyjnych, to z różną energią oddziałują z powierzchniowymi centrami adsorpcji. Należy zauważyć, że cząsteczki które adsorbują się silnie, desorbują się słabo i większą część czasu spędzają nieruchomo w fazie stacjonarnej. Natomiast te, które adsorbują się słabo większą część czasu spędzają w fazie ruchomej. Cząsteczki badanej substancji poruszają się tylko wtedy, gdy znajdują się w fazie ruchomej. Na rys. 2 przedstawiono szereg substancji (pochodnych benzenu), które uszeregowano według malejącej energii adsorpcji na żelu krzemionkowym.

Rys. 2. Porównanie energii adsorpcji związków w zależności od budowy i występowania grup funkcyjnych. Z przedstawionego na rys. 2 szeregu wynika, że najsilniej na żelu krzemionkowym adsorbuje się aminobenzen, zaś najsłabiej metylobenzen. Jeżeli w cząsteczce danej substancji występują dwie grupy funkcyjne (np. dwie grupy –NH2 w p-diaminobenzenie), to substancja ta będzie silniej adsorbowana niż zawierająca w cząsteczce tylko jedną grupę funkcyjną. Płytki do TLC W chromatografii cienkowarstwowej faza stacjonarna jest naniesiona w postaci cienkiej warstwy o grubości od 0,1 do 0,25 mm na płytkę szklaną lub aluminiową lub z tworzywa sztucznego o wymiarach 200×200mm, 200×50 mm lub 100×50 mm. Naniesiona warstwa musi być mechanicznie trwała i odporna na ścieranie. Najczęściej do fazy stacjonarnej dodaje się 0,1 – 10% tzw. lepiszcza, którym może być gips, skrobia, sole kwasów poliakrylowych i inne. Ze względu na detekcję substancji, warstwa adsorbentu zawiera także często trwale zaadsorbowany wskaźnik fluorescencyjny. W chromatografii cienkowarstwowej, podobnie jak w kolumnowej, do rozdzielania są wykorzystywane te same mechanizmy oddziaływań międzycząsteczkowych, a więc adsorpcja, wymiana jonowa, podział, czy warunki układu faz odwróconych. Jednakże ciągle dominującą rolę (w przeciwieństwie do chromatografii kolumnowej), odgrywa adsorpcja, a najczęściej stosowanymi adsorbentami są:  żel krzemionkowy – jeden z najbardziej popularnych adsorbentów stosowanych w chromatografii cienkowarstwowej. Jest on otrzymywany przez hydrolizę krzemianu sodu, oraz kondensację i polimeryzację w trakcie prażenia. Jego strukturę przedstawiono poniżej:

64

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Aktywność żelu krzemionkowego zapewniają grupy Si–OH (silanolowe) obecne na powierzchni. Producenci kontrolują aktywność żelu krzemionkowego na etapie prażenia. Żel stosowany w TLC ma średnicę ziaren w zakresie 5– krzemionkowego oznaczane są w następujący sposób: - żel krzemionkowy G –zawiera 13% gipsu jako czynnika wiążącego, - żel krzemionkowy H bez środka wiążącego, - żel krzemionkowy F254 ze wskaźnikiem fluorescencyjnym, - żel krzemionkowy UV254 ze wskaźnikiem fluorescencyjnym. Jako wskaźnik fluorescencyjny zazwyczaj stosowany jest siarczek cynku. Żel krzemionkowy ma odczyn lekko kwaśny i może być stosowany do rozdzielania: sterydów, aminokwasów, węglowodorów, tłuszczów, alkaloidów itp.  tlenek glinu – aktywność tlenku glinu związana jest z obecnością zarówno atomów tlenu jak i glinu.

Metoda produkcji polega na kondensacji uwodnionego wodorotlenku glinu. Może on być produkowany w trzech odmianach kwasowości powierzchni: formie kwasowej, zasadowej i obojętnej. Zasadowy tlenek glinu jest najbardziej popularny. Tlenek glinu jest używany do rozdzielania: sterydów, barwników, witamin i alkaloidów.  celuloza jest naturalnym polisacharydem zbudowanym z cząsteczek glukozy połączonych wiązaniami  (1,4) glikozydowymi.

Płytki TLC pokryte są cząsteczkami celulozy o podobnej wielkości ziaren, co powoduje regularny przepływ rozpuszczalnika. Celuloza jest stosowana do rozdzielania związków hydrofilowych, rozpuszczalnych jonów nieorganicznych i kwasów nukleinowych, które mogą zbyt silnie oddziaływać z tlenkiem glinu lub krzemionką. Oprócz tych typowych sorbentów w chromatografii cienkowarstwowej stosuje się także: proszek poliamidowy, modyfikowane celulozy o właściwościach jonowymiennych oraz żele organiczne o właściwościach sit molekularnych np. Sephadex, BioGel P i inne. Z nieorganicznych adsorbentów stosowanych w chromatografii cienkowarstwowej można 65

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

wymienić szkło sproszkowane, krzemian wapnia, hydroksyapatyt, siarczan wapnia, tlenek cyrkonu, tlenek tytanu, a nawet tlenek żelaza. Eluenty Natomiast fazę ruchomą stanowią zazwyczaj rozpuszczalniki organiczne. Powinny one być neutralne w odniesieniu do rozdzielanych substancji, wykazywać znaczną lotność par, co znacznie ułatwia osiągnięcie równowagi ciecz–gaz i niską gęstość, co przyspiesza usunięcie rozpuszczalnika z powierzchni płytki. W celu określenia siły oddziaływań, pomiędzy fazą ruchomą a powierzchnią nośnika, wprowadzono stałą dielektryczną (Eo) jako parametr odnoszący się do siły rozpuszczalnika. Jest to energia adsorpcji na jednostkę powierzchni standardowego adsorbenta. Przyładowo E°= 0, gdy prowadzona jest elucja pentanem na tlenku glinu. Generalnie, im większe wartości E°, tym silniej rozpuszczalnik oddziałuje z powierzchnią adsorbenta, i tym łatwiej cząsteczki związku będą się przemieszczały na płytce, co prowadzi do większej wartości RF. Warto zauważyć, że im większa polarność eluenta, tym większa wartość E°. Umownie do polarnych rozpuszczalników zalicza się te, dla których stała dielektryczna Eo > 4. Wartości RF substancji w każdej fazie ruchomej będą zależne od różnicy wartości siły rozpuszczalnika. Parametr siły rozpuszczalnika, który może być zmierzony, daje szereg eleuotropowy (elucyjny) rozpuszczalników zamieszczony w tabeli poniżej. Tabela 1. Szereg eleuotropowy rozpuszczalników (według wzrastającej polarności). Lp.

Rozpuszczalnik

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Eter naftowy Cyklohekasan Czterochlorek węgla Trójchloroetylen Toluen Benzen Dwuchlorometan Chloroform Eter etylowy Octan etylu Aceton n–Propanol Etanol Metanol Woda Kwas octowy

Polarność

Dozowniki próbek Roztwory badanych substancji nanosi się na płytki przy pomocy kapilar, strzykawek, mikropipet lub specjalnych automatycznych dozowników. Plamki analitów powinny charakteryzować się niewielkimi wymiarami (max. 2-3 mm), ponieważ występujący podczas elucji proces dyfuzji może powodować ich rozmywanie i w konsekwencji zniekształcać otrzymywane wyniki.

66

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Komory chromatograficzne Duże znaczenie w TLC ma budowa komór, w których następuje rozwijanie chromatogramów. W zależności od konstrukcji można wyróżnić wiele typów komór:  Komorv szklane pionowe (N) - są to duże naczynia szklane z wywiniętymi brzegami i uszczelnionymi szlifem pokrywami. Rozwijanie chromatogramu w kierunku z dołu do góry następuje po wstawieniu płytki do naczynia z eluentem. Dla polepszenia warunków tego procesu, komory wykłada się wewnątrz dodatkowo bibułą filtracyjną, dzięki czemu uzyskuje się jej nasycenie parami rozpuszczalnika.  Komorv Sandwicz (S) - są komorami płaskimi o małej objętości. Są zwykle układami nienasyconymi, jednak nasycenie możliwe jest do uzyskania poprzez zastosowanie bibuły filtracyjnej, podobnie jak w przypadku zwykłych komór pionowych.  Komory poziome (horyzontalne) – są częściej stosowane niż poprzednie typy, ponieważ umożliwiają wykorzystanie płytek o różnych kształtach. W najprostszych komorach płytkę umieszcza się nad poziomem rozpuszczalnika warstwą adsorbetu zwróconą do dołu lub do góry (Rys. 3).

Rys. 3. Przykład komory chromatograficznej poziomej.

Zasadę rozwijania chromatogramu w komorze poziomej przedstawiono na rysunku 4.

Rys. 4. Rozwijanie chromatogramu w komorze poziomej. 1 - płytka przykrywająca zbiornik eluentu, 2 zbiornik eluentu, 3 - płytka chromatograficzna, 4 - teflonowy korpus komory, 5 - płytka przykrywająca komorę, 6 - płytki przykrywające korytka, 7 - korytka, 8 - eluent

Rozwijanie chromatogramu rozpoczyna się przez przesunięcie płytek (1) do płytki chromatograficznej (3), co powoduje kontakt rozpuszczalnika z warstwą adsorbentu z obu stron. Na rys. 4 przedstawiono sytuację przed rozwijaniem chromatogramu (wariant 67

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

pierwszy) oraz podczas rozwijania (wariant drugi). Dzięki temu, że eluent tworzy menisk pionowy w zbiorniku eluentu, to podczas rozwijania chromatogramu rozpuszczalnik może być kompletnie wchłonięty przez warstwę adsorbentu. Komora umożliwia nasycanie warstwy adsorbentu parami rozpuszczalnika poprzez wprowadzenie kilku kropel eluentu lub innego rozpuszczalnika na dno korytek (7) po wcześniejszym wyjęciu płytek szklanych (6) i przed umieszczeniem płytki chromatograficznej w komorze. Detekcja chromatogramów Za pomocą TLC oznaczać można zarówno mieszaniny związków barwnych jak i bezbarwnych. Położenie plamek pierwszych z nich, ustala się zwykle bez dodatkowych czynności i środków, jeśli ich stężenie było odpowiednio duże. W przypadku związków bezbarwnych detekcję przeprowadza się na podstawie znajomości ich specyficznych właściwości i z użyciem odpowiednich czynników wywołujących. Metody wywoływania chromatogramów: - zastosowanie lampy UV (długości fali  = 254 i  = 366 nm); - wizualizacja przez spryskanie płytki czynnikiem wywołującym i obserwacja w świetle widzialnym lub UV. Analiza ilościowa Ilościowe oznaczanie rozdzielanych w cienkiej warstwie substancji można przeprowadzić w sposób: 1) pośredni - polegający na wyodrębnieniu substancji z nośnika i oznaczeniu jej ilości przy pomocy metod instrumentalnych (metoda grawimetryczna, spektrofotometryczna – UV, IR, kolorymetryczna); 2) bezpośredni - polegający na znalezieniu zależności pomiędzy wielkością plamki a ilością analizowanej substancji (planimetryczna metoda porównawcza, densytometria, fluorymetria, metoda wygaszania). Cele ćwiczenia Zapoznanie się z metodą separacji związków organicznych za pomocą TLC zwykorzystaniem horyzontalnej komory typu DS–M oraz ciśnieniowego chromatografu cienkowarstwowego. Dobór odpowiedniego eluenta z uwzględnieniem polarności składników mieszaniny. Wykonanie analizy otrzymanej próbki preparatu kosmetycznego, wydzielenie poszczególnych składników oraz ocena dokładności analizy. Zakres materiału naukowego Zagadnienia z zakresu chromatografii cienkowarstwowej – mechanizm rozdzielenia, parametry retencyjne, płytki chromatograficzne, eluenty, komory chromatograficzne, nanoszenie próbek, analiza jakościowa i ilościowa. Kwasy karboksylowe w preparatach kosmetycznych – podział, struktura i właściwości. Wykonanie ćwiczenia Uwagi: Analizę ekstraktu otrzymanego na drodze kwasowo/zasadowej ekstrakcji środków konserwujących używanych do produkcji kosmetyków, należy wykonać metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) tego samego dnia po otrzymaniu właściwej pochodnej. 68

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Próbki do analizy takie jak: balsamy do ciała, preparaty wybielające, środki do pielęgnacji skóry głowy, wyroby o działaniu przeciwłupieżowym, dostarcza osoba wykonująca ćwiczenie lub prowadzący. Aparatura, materiały, szkło Sprzęt laboratoryjny: komora pozioma do TLC (typu DS–M), lampa UV, kapilary, pipety, cylindry Łaźnia wodna, z możliwością utrzymania temperatury 60 °C Płytki chromatograficzne, Kieselgel 60, bez wskaźnika fluorescencyjnego, 10 × 10 cm, grubość warstwy 0,25 mm Mikrostrzykawka Suszarka z możliwością utrzymania temperatury do 105 °C Ogrzewana płytka Bibuła filtracyjna Uniwersalny papierek wskaźnikowy pH = l÷11 Kolby miarowe (50 ml) z gwintowanym korkiem Butelki (50 ml) z gwintowanym korkiem Szklane fiolki na wzorce (2 ml) Szklane fiolki na próbki (5 ml) Odczynniki Aceton cz.d.a. Eter dietylowy cz.d.a. Acetonitryl cz.d.a. Toluen cz.d.a. p-Ksylen cz.d.a. n-Heksan cz.d.a. Ciekła parafina Kwas solny, roztwór 4 M Zasada potasowa, roztwór wodny 4M Dihydrat chlorku wapnia cz.d.a. Węglan litu cz.d.a. 2-acetylo-7-bromonaftalen cz.d.a. Kwas 4-hydroksybenzoesowy (czystość ≥98%) Kwas salicylowy (czystość ≥98%) Kwas benzoesowy (czystość ≥98%) Kwas sorbinowy (czystość ≥98%) Kwas propionowy (czystość ≥98%) Roztwory odniesienia (wzorcowe) Przygotować roztwory o stężeniu (1 mg/ml) wszystkich pięciu środków konserwujących (kwasów karboksylowych) w eterze dietylowym. W tym celu odważyć w fiolach po 10 mg każdego z oznaczanych kwasów karboksylowych i rozpuścić w 10 ml eteru dietylowego. Odczynnik do otrzymywania pochodnych Przygotować roztwór 2-acetylo-7-bromonaftalenu w acetonitrylu o stężeniu 5 mg/ml. W tym celu odważyć w kolbie 50 mg tego związku i rozpuścić w 10 ml acetonitrylu. Roztwór przechowywać w lodówce; trwałość 1 tydzień. Roztwór katalizatora

69

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Przygotować roztwór węglanu litu w wodzie o stężeniu 3 mg/l. W tym celu odważyć w kolbie 150 mg węglanu litu i rozpuścić w 50 ml wody. Roztwór powinien przygotowany podczas każdej pracowni. Eluent do rozwijania chromatogramów 1. Przygotować mieszaniny: toluen/aceton (20:0,5 v/v), p-ksylen/aceton (20:0,5 v/v) 2. Przygotować mieszaninę: ciekła parafina/n-heksan (l:2 v/v) Przygotowanie próbki W kolbie miarowej o pojemności 50 ml z gwintowanym korkiem odważyć około l g próbki z dokładnością do 0,001 g. Dodać cztery krople 4 M kwasu solnego i 40 ml acetonu. Dla silnie alkalicznych wyrobów, takich jak mydło toaletowe, należy dodać 20 kropli 4 M kwasu solnego. Papierkiem wskaźnikowym sprawdzić odczyn pH, który powinien wynosić około 2. Zamknąć kolbę i wytrząsać energicznie w ciągu jednej minuty. Jeśli konieczne jest przyspieszenie ekstrakcji środka konserwującego do fazy acetonowej, należy ogrzewać łagodnie mieszaninę w temperaturze do 60 °C, w celu rozpuszczenia badanej próbki. Następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i przesączyć przez bibułę filtracyjną do kolby stożkowej. Przenieść 20 ml przesączu do 200 ml kolby stożkowej, dodać 20 ml wody i wymieszać. Skorygować odczyn mieszaniny do pH około 10, z wykorzystaniem zasady potasowej (4 M). Odczyn pH sprawdzić za pomocą papierka wskaźnikowego. Dodać l g chlorku wapnia i energicznie wytrząsnąć. Przesączyć przez bibułę filtracyjną do 250 ml rozdzielacza, zawierającego 75 ml eteru dietylowego i wytrząsać energicznie w ciągu 1 minuty. Pozostawić do rozdzielenia i przenieść warstwę wodną do 250 ml kolby stożkowej. Odrzucić warstwę eterową. Używając papierka wskaźnikowego, doprowadzić odczyn do pH około 2, z wykorzystaniem kwasu solnego (4 M). Dodać 10 ml eteru dietylowego, zamknąć kolbę i wytrząsać energicznie w ciągu jednej minuty, pozostawić do rozdzielenia i przenieść warstwę eterową do wyparki rotacyjnej. Odrzucić warstwę wodną. Odparować warstwę eterową prawie do sucha i ponownie rozpuścić pozostałość w l ml eteru dietylowego. Przygotowany roztwór (próbkę) przenieść do fiolki. Nanoszenie próbek na cienką warstwę Na płytkę do chromatografii cienkowarstwowej, dla wszystkich roztworów odniesienia i próbek analizowanych, nanieść strzykawką po około 3 l węglanu litu w równych odległościach na linii początkowej, w strefie nanoszenia i wysuszyć w strumieniu zimnego powietrza. Aby otrzymać możliwie najmniejsze plamy, umieścić płytkę w suszarce nagrzanej do 40 °C. Nanieść mikrostrzykawką po l µl wszystkich roztworów wzorcowych i roztworu próbki na linii startu, dokładnie w miejscach plam, w których naniesiono roztwór węglanu litu. Nanieść ponownie po około 15 l odczynnika do otrzymywania pochodnych (roztworu 2acetylo-7-bromonaftalenu), dokładnie w miejscach plam, w których naniesione były roztwory odniesienia i próbki oraz roztwór węglanu litu. Ogrzewać płytkę do chromatografii cienkowarstwowej w suszarce w 80 °C w ciągu 45 minut. Po schłodzeniu rozwijać chromatogram w komorze poziomej, używając mieszaniny rozpuszczalników (toluen/aceton oraz p-ksylen/aceton), aż do osiągnięcia przez czoło rozpuszczalnika dystansu 8 cm (czas trwania około 10 minut). Wysuszyć płytkę w strumieniu zimnego powietrza i ocenić otrzymane chromatogramy w świetle UV. Dla wzmocnienia fluorescencji słabo widocznych plam, płytkę można zanurzyć (na ok. 10 s) w mieszaninie ciekła parafina/n-heksan. Identyfikacja Obliczyć współczynnik RF dla wszystkich plam. Porównać wartość RF i zachowanie próbki pod wpływem promieniowania UV z wartościami otrzymanymi dla roztworów odniesienia. Sformułować wstępny wniosek o obecności i zidentyfikowaniu środka konserwującego 70

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

znajdującego się w próbce. Podsumować wyniki otrzymane metodą TLC i potwierdzić ostateczną identyfikację środków konserwujących znajdujących się w próbce na podstawie otrzymanych wyników. Opracowanie wyników: Wyznaczyć parametry retencyjne dla poszczególnych składników i przedstawić w poniższej tabeli dla każdego ze stosowanych składów fazy ruchomej. Eluent

Barwa plamki

Dystans [cm] punkt startu – front eluenta

Dystans [cm] punkt startu – środek plamy

RF

RM

k

1.

2.

Wyjaśnić, jak zmienia się kolejność migracji związków wraz ze zmianą składu fazy ruchomej. Przedyskutować, która z zastosowanych faz ruchomych jest wskazana do rozdzielenia badanego ekstraktu i dlaczego? Literatura 1. J. Sherma, T. Kowalska, M. Waksmundzka-Hajnos (red.), Thin Layer Chromatography in Phytochemistry, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton 2008. 2. T.H. Dzido, D. Polit, Retention of Aromatic Hydrocarbons with Polar Groups in Binary Reversed-Phase Thin-Layer Chromatography, J. Planar Chromatogr., 14 (2001) 80-87. 3. T.H. Dzido, B. Polak, On Methodical Possibilities of the Horizontal Chambers in PLC, w: Preparative Layer Chromatography (red. T. Kowalska, J. Sherma), CRC Press, Taylor and Francis Group, Boca Raton, 2006, s. 131–162. 4. J. Sherma, Preparative Layer Chromatography in Food Analysis, in Handbook of Food Analysis Instruments, Semith Ötleş, ed., CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton 2009, pp. 148,150. 5. A. Bazylko, H. Strzelecka, A HPTLC densitometric determination of luteolin in Thymus vulgaris and its extracts, Fitoterapia, 78 (2007) 391-395. 6. http://www.chromdes.com/ 7. http://www.umlub.pl/kosmetologia/ 8. E. Hahn-Deinstrop, Applied thin-layer chromatography, Wiley-VCH, Weinheim 2000. 9. G. Matysik, Problemy optymalizacji chromatografii cienkowarstwowej, Baccarat, Lublin 1997. 10. J. Opieńska–Blauth H. Kraczkowski, H. Brzuszkiewicz, Zarys chromatografii cienkowarstwowej, WWRiL, Warszawa 1967. 11. A. Strzelecka, Praca magisterska, Toruń 1996. 12. Z. Suprynowicz, Współczesne kierunki w chromatografii, Lublin 1986. 13. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, PWN Warszawa 1992. 14. Sz. Nyiredy, Planar Chromatography, Springer, Budapest 2001. 15. Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 178, 28/07/1995 P. 0020 - 0035 (Dz.U.UE.L.1995.178.20; Dz.U.UE-sp.13-15-171). 71

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 8 WYZNACZANIE SUMARYCZNEJ ZAWARTOŚCI ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH W PREPARATACH KOSMETYCZNYCH Wstęp Wskaźnik ten, w światowej literaturze oznaczany symbolem TOC (ang. Total Organic Carbon), określa sumaryczne stężenie organicznych związków węgla zawartych w próbce. Wyrażany jest najczęściej w mg C na jednostkę objętości, w przypadku próbek ciekłych jest to dm3 (ppm). Istnieje kilka metod wyznaczania OWO w cieczach, w tym w kosmetykach. Metoda katalitycznego spalania w wysokiej temperaturze. Jest ona realizowana w analizatorze, którego schemat przedstawia rysunku 1. Metoda ta polega na bezpośrednim wstrzyknięciu próbki ciekłej do rozgrzanego pieca (600-800°C) wypełnionego katalizatorem (Pt, Pd, CuO, V2O3) w obecności tlenu. Powstający ditlenek węgla jest osuszany z pary wodnej i oznaczany za pomocą niedyspersyjnego detektora w podczerwieni NDIR. Oznaczony w ten sposób tzw. węgiel ogółem (WO) stanowi sumę węgla organicznego (OWO) i nieorganicznego (OWN) znajdującego się w próbce w postaci węglanów, wodorowęglanów oraz wolnego ditleneku węgla. Ogólny węgiel nieorganiczny (OWN) jest oznaczany w równoległym do układu oznaczania WO, układzie analitycznym poprzez wyparcie ditlenku węgla z jego związków w reakcji z rozcieńczonym kwasem fosforowym(V). Następnie jest on osuszany z pary wodnej i oznaczany za pomocą detektora NDIR. Ogólny węgiel organiczny jest obliczany jako różnica węgla ogółem i ogólnego węgla nieorganicznego: OWO = WO - OWN (ang. TOC = TC - TIC).

Rys. 1. Schemat działania analizatora OWO (TOC). Analiza OWO zajmuje tylko kilka minut, dlatego jest bardzo przydatna do kontroli jakości preparatów kosmetycznych. Pozwala ona na określenie sumarycznej zawartości związków węgla w badanym preparacie. Nie pozwala na określenie grup związków wchodzących w skład badanego preparatu (kwasy, tłuszcze, oleje, alkohole i inne). Mimo tej niedogodności analiza OWO jest podstawowym badaniem wykonywanym w laboratoriach. 72

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Zakres materiału Parametry sumaryczne (BZT, ChZT, OWO), budowa analizatora OWO, metody wyznaczania OWO w próbkach ciekłych, skład fizykochemiczny szamponów, mydeł. Wykonanie ćwiczenia Sprzęt, materiały i odczynniki 1. Kwas siarkowy(VI) H2SO4 roztwór 2 mol/dm3, 2. Analizator węgla TOC–L firmy SHIMADZU, 3. Mieszadło magnetyczne, 4. Pipeta jednomiarowa - 50 ml, 5. Pipeta wielomiarowa - 1 ml, 6. Kolby miarowe 100 ml, 50 ml, 7. Zlewki na 100 ml. Wykonanie oznaczenia 1. Włączyć analizator zgodnie z instrukcją obsługi. 2. Przygotować w kolbach miarowych o pojemności 50 ml roztwory wzorcowe TC (np. 500, 250, 100, 50 mg/dm3) i IC (np. 250, 100, 50, 25 mg/dm3) przez odpowiednie rozcieńczenie roztworu podstawowego (1000 mg/dm3). 3. Zgodnie z instrukcją obsługi aparatu przygotować krzywe kalibracyjne. 4. W kolbach miarowych o pojemności 100 ml przygotować próbki do oznaczenia TOC. W tym celu 100 l próbki (szampon, mydło w płynie, płyn do demakijażu) rozcieńczyć w kolbie. 5. Oznaczyć zawartość węgla: całkowitego, organicznego i nieorganicznego w badanej próbce dwoma metodami: a) pomiar WO i OWN za pomocą analizatora; b) pomiar WO równoważnego za pomocą analizatora po uprzednim usunięciu OWN poza aparatem w następujący sposób: do zlewki odmierzyć pipetą 50 ml badanej próbki, następnie dodać 0,5 ml 2 mol/dm3 kwasu siarkowego(VI) i całość mieszać mieszadłem magnetycznym przez 20 min. Po stwierdzeniu braku OWN za pomocą analizatora dokonać analizy WO, wielkości równoważnej OWO. 6. Wyłączyć analizator zgodnie z instrukcją obsługi. Literatura 1. W. Hermanowicz, J. Dojlido, W. Dożańska, B. Koziorowski,J. Zerbe, Fizyczno-chemiczne badanie wody i ścieków, Arkady, Warszawa, 1999, 2. SHIMADZU TOC-L Instruction Manual.

73

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 9 KLASYCZNE METODY ANALITYCZNE W OKREŚLANIU ZAWARTOŚCI NADTLENKU WODORU W WODZIE UTLENIONEJ Wstęp Nadtlenek wodoru dostępny jest w postaci wody utlenionej. Preparat ma właściwości dezynfekcyjne poprzez wydzielania tlenu atomowego w kontakcie z materią organiczna. Chętnie jest stosowany do odkażania i przemywania ran, a także w drobnych otarciach i skaleczeniach. Jest tanim i uniwersalnym środkiem odkażającym używanym do płukania gardła i uszu. W kosmetyce stosowany jest jako składnik farb do włosów, preparatów do barwienia brwi. Nadtlenek wodoru ulega powolnemu rozkładowi, szczególnie pod wpływem światła i podwyższonej temperatury. Rozkład jest katalizowany przez wiele rozrobionych metali, tlenków metalicznych czy powierzchnię węgla. W układach biologicznych reakcja jest katalizowana przez enzym katalazę. Trwałość handlowych preparatów wody utlenionej jest ograniczona przez powolny ale stały rozkład nadtlenku wodoru. Miareczkowanie manganometryczne Oznaczanie nadtlenku wodoru jest możliwe dzięki redukcji jonów manganianu (VII) o barwie fioletowej do jonów manganu (II) przez nadtlenek wodoru. W trakcie reakcji obserwuje się zanik charakterystycznego fioletowego zabarwienia pochodzącego od dodawanego titr anta oraz wydzielanie tlenu. Po przereagowaniu całej ilości nadtlenku pojawia się lekko fioletowe zabarwienie pochodzące od nadmiaru jonów manganianowych. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie studentów z metodyką oznaczania nadtlenku wodoru w handlowej w postaci wody utlenionej spełniającej wymogi Farmakopei Polskiej. Zakres materiału naukowego Wyznaczanie punktu równoważnikowego, redoksometria, równania redoks, stopnie utleniania manganu, właściwości nadtlenku wodoru, wskaźnik redoks. Wykonanie ćwiczenia Wyposażenie: Biureta szklana, Pipeta wielomiarowa 20 ml (1 szt.), Kolby stożkowe 250 ml (3 szt.), Naczynka wagowe (3 szt), Szklane bagietki (3 szt.), Cylinder miarowy 100 mlPłytka grzejna (1 szt.) Okulary ochronne (1 szt.) Odczynniki: Roztwór KMnO4 o stęż. ok. 0.02 mol/l, Kwas siarkowy rozcieńczony w stos. obj. 1:4, zawierający 0,05% MnSO4. Kwas siarkowy rozcieńczony w stos. obj. 1:4. Kwas szczawiowy (dwuwodny hydrat) w postaci stałej do wykonania naważek. 74

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Wykonanie 10 ml wody utlenionej odmierzyć za pomocą pipety jednomiarowej i wlać do kolby miarowej 100 ml oraz rozcieńczyć wodą destylowaną do kreski. Po wymieszaniu, odpipetować po 10 ml próbki do trzech kolb stożkowych. Następnie dodać do każdej z nich po 10 ml kwasu siarkowego. Miareczkować nadmanganianem potasu do pojawienia się bladoróżowej barwy. Miareczkowanie wykonać dla pozostałych próbek. Mianowanie roztworu nadmanganianu Na wadze analitycznej odważyć 70-80 mg kwasu szczawiowego i przesypać do kolby stożkowej, dodać 80 ml wody destylowanej a następnie 10 ml kwasu siarkowego z katalizatorem. Następnie włożyć do kolby bagietkę i ostrożnie ogrzewać kolbę z roztworem niemalże do wrzenia. Zachować ostrożność przy posługiwaniu się gorącym roztworem. Szyjkę kolby ostrożnie owinąć papierowym ręcznikiem i gorący roztwór miareczkować za pomocą roztworu nadmanganianu do pojawienia się trwałej bladoróżowej barwy (unikać nadmiaru titranta). Miareczkowanie powtórzyć 3-krotnie. Na podstawie zużytego roztworu nadmanganianu obliczyć jego miano. 2 MnO4- + 5C2O4 2- + 16 H3O+ → 2 Mn2+ + 10 CO2 + 24 H2O Obliczenie zawartości nadtlenku wodoru Do obliczeń należy użyć mianowanego stężenia nadmanganianu. Biorąc pod uwagę objętość próbki wody utlenionej i jej ilość użytą do miareczkowania obliczyć zawartość H2O2 w kolbie. Końcowy wynik podać w przeliczeniu na czysty H2O2 w preparacie handlowej wody utlenionej (mg/ 100 ml roztw.) Reakcja zachodzi zgodnie z równaniem: 2 MnO4- + 5 H2O2 + 6H3O+ → 2Mn2+ +5O2 + 8H2O Zawartość nadtlenku wodoru w próbce (𝑚𝐻2 𝑂2 [𝑔]), mając na uwadze miano titranta (𝑐𝐾𝑀𝑛𝑂4 [

𝑚𝑜𝑙 𝑙

]), obliczyć zgodnie ze wzorem: 𝑚𝐻2 𝑂2 =

5 ∙ 𝑐𝐾𝑀𝑛𝑂4 ∙ 𝑀𝐻2 𝑂2 ∙ 𝑉𝐾𝑀𝑛𝑂4 2

(1)

gdzie: 𝑉𝐾𝑀𝑛𝑂4 - objętość roztworu KMnO4 [l], 𝑀𝐻2 𝑂2 - masa molowa nadtlenku wodoru [mol/g]. Literatura 1. A.Cygański, Chemiczne metody analizy ilościowej, WNT 1999. 2. Z.S. Szmal, T. Lipiec, Chemia analityczna z elementami analizy instrumentalnej, PZWL, Warszawa, 1996. 75

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki 3. J. Minczewski, Z. Marczenko, Chemia analityczna. Tom.2., Chemiczne metody analizy ilościowej, Wydawnictwa Naukowe PWN, Warszawa 2007.

76

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 10 OZNACZANIE SODU W PREPARATACH KOSMETYCZNYCH ZA POMOCĄ FOTOMETRII PŁOMIENIOWEJ Wstęp Makroelementy (makrominerały, makroskładniki) są to pierwiastki niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu, które muszą być dostarczane np. z pożywieniem. Ich zapotrzebowanie dla człowieka przekracza 100 mg na dobę. Do tej grupy zalicza się tzw. pierwiastki biogenne, które odgrywają kluczową rolę w budowie żywych organizmów na Ziemi. Makroelementami są: azot, wapń, potas, fosfor, magnez, siarka, sód, chlor, wodór, tlen, węgiel. Mikroelementy, zwane też pierwiastkami śladowymi, występują w organizmach roślinnych i zwierzęcych w bardzo małych ilościach. Są one niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmów, a ich niedobór może prowadzić do zaburzeń fizjologicznych. Należą do nich żelazo, cynk, miedź, mangan, molibden, bor, jod i fluor. Obie grupy związków to elementy, które mają bardzo korzystny wpływ na organizm człowieka oraz ogromne znaczenie biologiczne. Do prawidłowego przebiegu wszystkich procesów zachodzących w skórze niezbędne jest około 30 minerałów, które muszą zostać do organizmu dostarczone. Obecnie, poza drogą pokarmową, poszukuje się nowych sposobów dostarczania makro- i mikroelementów. Z tego względu preparaty kosmetyczne są wzbogacane w minerały. Występują one w kosmetykach w postaci kwasów, zasad lub soli, podobnie jak w układach naturalnych. Biopierwiastki są składnikami toników, kremów, wód termalnych, soli, maseczek, preparatów typu serum. Kosmetyki tego typu przyczyniają się do odbudowy mineralnej komórek oraz regeneracji skóry (Tabela 1). Podwyższone stężenie minerałów w kosmetykach powoduje zwiększenie ciśnienia osmotycznego, co z kolei korzystnie wpływa na szybkość wchłaniania makro- i mikroelementów, a w konsekwencji na szybkość procesu regeneracji skóry. Sole do kąpieli, toniki i płyny do demakijażu Sód występuje w największej ilości w solach do kąpieli. Działają one relaksująco, wzmacniająco na skórę, a w niektórych wypadkach oczyszczająco (w przypadku peelingu). Sól morska umożliwia wygładzenie skóry, a co ważniejsze - usuwa z jej powierzchni martwe komórki. Dodatkowo zawarte w jej składzie minerały wzmacniają skórę. Sole do kąpieli stosowane są także w przypadku leczenia niektórych podrażnień skóry. Tabela 1. Charakterystyka wybranych makroelementów i ich wpływ na skórę. Pierwiastek SÓD

Występowanie w organizmie przede wszystkim w płynach ustrojowych, natomiast w tkankach występuje w małych ilościach

POTAS

głównie w komórkach organizmu, w płynach pozakomórkowych w małych ilościach

WAPŃ

wchodzi w skład układu kostnego (główny składnik)

Działanie poprawia ukrwienie skóry, reguluje ciśnienie osmotyczne, poprawia nawilżenie skóry ujędrnia skórę, wspomaga regulację gospodarki wodnej, usprawnia metabolizm, wspomaga leczenie alergii wspomaga witaminę C w budowaniu struktury kolagenowej; wspomaga odbudowę naskórka, wzmacnia go; 77

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

MAGNEZ

przede wszystkim w kościach, ponadto jest aktywatorem wielu enzymów

przeciwdziała wysuszeniu skóry; działa antyalergicznie; bierze udział w większości biochemicznych reakcji organizmu wzmacnia skórę; bierze udział w regeneracji komórek; ma właściwości przeciwzapalne; dostarcza energii komórkom; stanowi barierę przed atakiem wolnych rodników; działa tonizująco, opóźnia procesy starzenia.

Sole sodowe są także istotnym dodatkiem do płynów do demakijażu oczu. Sód występuje w tym przypadku w postaci chlorku sodu, soli sodowej kwasu dietylenoaminotetraoctowego, soli sodowej kwasy mlekowego, itp. Dodatek tego typu soli ma działanie stabilizujące, jak również zmiękczające i nawilżające. Ze względu na liczne zalety, wiele preparatów kosmetycznych wzbogacanych jest obecnie w sól morską lub jej ekstrakty. Należą do nich: toniki, peelingi, spray do włosów, szampony itp. Dodatki soli morskiej posiadają kojące, łagodzące i przeciwrodnikowe właściwości. Metody oznaczania składników mineralnych

Różnorodny skład mineralny preparatów kosmetycznych oraz niski poziom stężeń makro- i mikroelementów sprawia, iż dobór odpowiedniej metody ich oznaczenia jakościowego i ilościowego jest procesem trudnym. Stosowanych jest wiele technik, a do najpopularniejszych należą: metody miareczkowe, spektrofluorymetryczne, z wykorzystaniem elektrod jonoselektywnych, emisyjna spektrometria atomowa (AES - Atomic Emission Spectrometry), absorpcyjna spektrometria atomowa, spektrometria mas z jonizacją w plazmie wzbudzonej indukcyjnie, metody chromatograficzne (np. chromatografia jonowymienna). Metodami miareczkowymi w szybki sposób oznaczyć można zawartość wapnia i magnezu w wybranym preparacie kosmetycznym. Czułe oznaczanie kilkudziesięciu różnych kationów i anionów możliwe jest dzięki zastosowaniu odpowiednich elektrod jonoselektywnych. Ograniczeniem tej metody jest jednak niska powtarzalność i oraz znaczący wpływ matrycy na końcowy wynik oznaczenia. Z kolei wykorzystanie metod spektrometrycznych pozwala na oznaczenie wielu pierwiastków z wysoką czułością (nawet na poziomie śladów). AES to technika bazująca na interpretacji widm emisyjnych emitowanych podczas pomiaru przez wzbudzone atomy. Mogą one być wzbudzane w płomieniu, wówczas metoda ta nosi nazwę fotometrii płomieniowej. Fotometria płomieniowa Płomieniowa emisyjna spektrometria atomowa, czyli fotometria płomieniowa, wykorzystywana jest do analiz pierwiastków o niskich potencjałach wzbudzenia (1,4-3,0 eV), głównie litowców i berylowców. Pomiar odbywa się poprzez wprowadzenie analizowanych pierwiastków do płomienia palnika przez nebulizator, w którym dochodzi do rozpylenia roztworu. W płomieniu pierwiastki ulegają wzbudzeniu. Przebiega ono w kliku etapach: odparowanie roztworu, dysocjacja termiczna oznaczanych związków na atomy, wzbudzenie termiczne swobodnych atomów w wyniku zderzeń z cząsteczkami i atomami o dużych energiach kinetycznych gazu w wysokiej temperaturze płomienia. Po zderzeniu część energii kinetycznej zostaje zamieniona na energię potencjalną stanu wzbudzonego. Jest to konsekwencja przeniesienia 78

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

elektronów walencyjnych z orbitali stanu podstawowego na orbitale o wyższej energii. Wzbudzenie jest procesem nietrwałym, w związku z czym elektrony powracają do niższych energetycznych stanów podstawowych, które są trwałe. Procesowi temu towarzyszy emisja promieniowania elektromagnetycznego związana z różnicą energii. Jest ona emitowana przez atom w postaci światła monochromatycznego o określonej długości fali (λ). Promieniowanie jest kierowane przez monochromator do detektora. Tam zostaje zamienione na sygnał elektryczny proporcjonalny do intensywności promieniowania. Powstały prąd przesyłany jest i mierzony przez rejestrator (rys. 1).

Rys. 1. Schemat fotometru płomieniowego [BWB Technologies, A guide to flame photometer analysis, 2012].

Długość fali ściśle zależy od różnicy energii przejścia elektronu walencyjnego z poziomu wzbudzenia (linia rezonansowa) o energii Ew na poziom podstawowy o energii Ep. ΔE = Ew - Ep ΔE = h·c·λ λ = ΔE/c·h

(1) (2) (3)

gdzie: h – stała Plancka 6,63·10-34 (J·s), c – prędkość światła 2,99·108 (m·s-1), λ – długość fali promieniowania emitowanego (nm). Całkowita energia promieniowania o danej długości fali emisji (Iem) jest ściśle zależna od stężenia atomów danego pierwiastka (c) powstałych w płomieniu palnika w wyniku dysocjacji termicznej. Dla wysokich stężeń zależność ta ma przebieg wykładniczy; Iem = a • c b, gdzie a i b są stałymi empirycznymi zależnymi od warunków doświadczenia (stężenia substancji) (rys. 2). Dla niskich stężeń stała b jest bliska jedności i zależność wykładnicza przekształca się w równanie liniowe; Iem = a·c. Na podstawie zależności liniowej natężenia emitowanego promieniowania i stężenia oznaczanej próbki jesteśmy w stanie przeprowadzać analizy ilościowe. Technika ta jest wykorzystywana do oznaczeń ilościowych metodą krzywej wzorcowej lub dodatku wzorca. Wykorzystywana jest zależność, iż całkowita intensywność emitowanego promieniowania o danej długości fali jest proporcjonalna do stężenia atomów danego pierwiastka wydzielonych w płomieniu w procesie dysocjacji termicznej. Fotometrię płomieniową stosuje się najczęściej do analizy sodu, potasu i wapnia.

79

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Intesywność emisji

100

75

50

25

0 0

20

40

60

80

100

Stężenie Na [ppm]

Rys. 2. Zależność wykładnicza intensywności emisji od stężenia. Do głównych zalet fotometrii płomieniowej zaliczyć należy przede wszystkim prostą budowę aparatów i ich prostą obsługę. Metoda ta umożliwia szybkie analizy jakościowe i ilościowe metali alkalicznych i ziem alkalicznych w różnych matrycach (biologicznych, klinicznych lub przemysłowych). Z kolei główne ograniczenia fotometrii płomieniowej to duża liczba parametrów bezpośrednio wpływająca na jakość analizy: nierównomierny przepływ gazu palnego wpływa na temperaturę płomienia, co bezpośrednio wpływa na proces odparowania, atomizacji, a w konsekwencji na zmiany natężenia emitowanego promieniowania. Rodzaj rozpuszczalnika wpływa natomiast na tworzenie aerozolu i na proces odparowania. Czas przebywania atomów w płomieniu wpływa na proces nebulizacji.

Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest praktyczne zapoznanie się z metodą oznaczania sodu za pomocą fotometrii płomieniowej. Oznaczony zostanie poziom stężenia tego pierwiastka w kilku różnych preparatach kosmetycznych. Zakres materiału naukowego Makroelementy, mikroelementy – występowanie, znaczenie, działanie. Makro- i mikroelementy w kosmetykach. Metody oznaczania pierwiastków. Fotometria płomieniowa – definicja, zasada metody, budowa aparatury. Krzywa kalibracyjna.

UWAGA!!! Student może przynieść swoje własne preparaty kosmetyczne zawierające sód (sól do kąpieli, tonik lub płyn do demakijażu oczu) Wykonanie ćwiczenia Aparatura i szkło laboratoryjne Kolby miarowe o pojemności 50 ml (11 szt.), kolby miarowe o pojemności 10 ml (2 szt.), pipeta szklana wielomiarowa o pojemności 25 ml (1 szt.), pipeta szklana jednomiarowa o pojemności 5 ml (1 szt.), pipeta szklana jednomiarowa o pojemności 20 ml (1 szt.), pipeta szklana jednomiarowa o pojemności 25 ml (1 szt.), pipeta szklana wielomiarowa o pojemności 1 ml (1 szt.), zlewki o pojemności 100 ml (6 szt.), fiolki o pojemności 20 ml (7 szt.), szkiełko zegarkowe, bagietka. Fotometr płomieniowy BWB-XP firmy BWB Technologies UK LTD, waga analityczna. 6. Odczynniki 80

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki Roztwór podstawowy NaCl (0,4 g/L) Wykonanie ćwiczenia Przygotowanie krzywej kalibracyjnej Korzystając z roztworu podstawowego sodu o stężeniu 0,4 g/L przygotować w kolbach miarowych na 50 ml roztwory o stężeniach 200, 100, 50, 20, 10, 5 mg/L (każdy roztwór w dwóch powtórzeniach). Zastosować metodę kolejnych rozcieńczeń. W celu ułatwienia pipetowania oraz wykonania analizy poszczególne roztwory przelać do zlewek lub fiolek o pojemności 20 ml. Przygotowanie roztworów preparatów kosmetycznych do analiz Odważyć na wadze analitycznej 0,05-0,10 g soli do kąpieli. Przenieść ilościowo do kolby miarowej na 50 ml i dopełnić wodą destylowaną do kreski. Odmierzyć 5 ml toniku do twarzy do kolby miarowej na 10 ml i dopełnić wodą destylowaną do kreski. Roztwór płynu do demakijażu przygotować poprzez odmierzenie 1 ml preparatu do kolby miarowej o pojemności 10 ml i dopełnienie do tej objętości wodą destylowaną. Wykonanie pomiarów za pomocą fotometru płomieniowego Pomiary wykonywać za pomocą fotometru płomieniowego BWB-XP firmy BWB Technologies. Dokonać pomiaru zawartości sodu w roztworach do krzywej kalibracyjnej. Następnie wykonać analogiczne pomiary dla badanych próbek. Analizy wykonywać zgodnie ze skróconą instrukcją obsługi umieszczoną przy fotometrze płomieniowym.

UWAGA!!! Podczas analiz preparatów kosmetycznych

w przypadku uzyskania wartości wyższych niż wskazania dla najwyższego stężenia roztworu kalibracyjnego, próbkę należy rozcieńczyć i powtórzyć pomiar. Opracowanie wyników 1. Otrzymane wyniki należy zestawić w tabeli. 2. Krzywą kalibracyjną wraz z równaniem oraz współczynnikiem determinacji należy wyznaczyć w programie Excel i dołączyć do opracowania. Na podstawie równania krzywej obliczyć stężenie sodu w próbkach. Przy obliczeniach należy uwzględnić ilości próbki oraz ewentualne rozcieńczenia próbek. Wyniki przeliczyć na litr płynu do demakijażu lub toniku do twarzy oraz kilogram soli do kąpieli. 3. Przedyskutować otrzymane wyniki i powstałe błędy pomiarowe.

Literatura 1. Kocjan R., Chemia analityczna. Podręcznik dla studentów. Analiza instrumentalna, Wydawnictwo PZWL 2. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej, Wydawnictwo naukowe PWN 3. Minczewski J., Marczenko Z., Chemia analityczna. Chemiczne metody analizy ilościowej, Tom 2, Wydawnictwo PWN 4. Cygański A., Metody spektroskopowe w chemii analitycznej, Wydawnictwo naukowo-techniczne 5. BWB Technologies, A guide to flame photometer analysis, 2012 6. Molski M., Chemia piękna, Wydawnictwo Naukowe PWN 2009. 7. Kaniewska M., Kosmetologia. Podstawy, Wydawnictwa Szkolne i Pedagogiczne, 2011.

81

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 11 ZAWARTOŚĆ GLUKOZY W PEELINGACH CUKROWYCH – ANALIZA SPEKTROFOTOMETRYCZNA Wstęp Węglowodany są aldehydami lub ketonami zawierającymi dwie lub więcej grup hydroksylowych oraz ich pochodnymi o ogólnym wzorze empirycznym: (CH 2O)n, gdzie n ≥ 3. Wyróżnia się trzy klasy sacharydów:  monosacharydy – węglowodany nie ulegające hydrolizie do prostych cukrów  oligosacharydy – węglowodany, które hydrolizują do kilku, kilkunastu cząsteczek monosacharydów (w organizmach najczęściej występują disacharydy połączone wiązaniem O-glikozydowym)  polisacharydy – węglowodany hydrolizujące do wielu cząsteczek monosacharydów Monosacharydy są ważnym paliwem energetycznym oraz cząsteczkami budulcowymi kwasów nukleinowych. W zależności od tego czy zawierają grupę aldehydową, czy ketonową, cukry proste dzieli się, odpowiednio, na aldozy i ketozy. Najprostsze węglowodany o n = 3 to dihydroksyaceton oraz aldehyd D- i L-glicerynowy (Rys. 1). Nazywa się je ogólnie triozami. A)

B)

Rys. 1. Wzór strukturalny aldehydu D-glicerynowego (A) i L-glicerynowego (B). Pod względem długości łańcucha węglowego monosacharydy można dalej podzielić na tetrozy, pentozy, heksozy itd. Monosacharydy zawierają jeden lub więcej asymetrycznych atomów węgla, wykazując przy tym czynność optyczną i tworząc 2n form stereoizomerycznych (enancjomerów) i 2n-1 diastereoizomerów, gdzie n oznacza liczbę asymetrycznych atomów węgla w cząsteczce. Enancjomery to wzajemne odbicia lustrzane, ale nie dające się na siebie nałożyć. Wykazują identyczne właściwości fizyczne i chemiczne, z wyjątkiem skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Stereoizomery, które nie są swoimi wzajemnymi odbiciami lustrzanymi, nazywane są diastereoizomerami. Szczególnym typem diastereoizomerów są epimery, czyli cukry różniące się konfiguracją wokół jednego asymetrycznego centrum, np. D-glukoza i D-galaktoza to epimery względem C-4.

82

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

A)

B)

Rysunek 2. D-glukoza (A) i D-galaktoza (B) jako epimery względem atomu węgla 4 (C-4). Grupa aldehydowa lub ketonowa może reagować z grupą hydroksylową tworząc wiązanie kowalencyjne. W wyniku reakcji między grupą aldehydową lub ketonową a grupą hydroksylową cukru (alkohol) powstają odpowiednio wewnątrzcząsteczkowe hemiacetale i hemiketale, tworząc sześcioczłonowe pierścienie piranozowe lub pięcioczłonowe furanozowe. Schemat tworzenia hemiacetali i acetalu z aldehydu zamieszczono na rysunku 3.

aldehyd hemiacetal acetal Rysunek 3. Schemat powstawania hemicaetalu i acetalu z aldehydu [6].

,D-glukopiranoza

D-glukoza ,D-glukopiranoza

Rys. 4. Cyklizacja otwartej formy łańcuchowej glukozy z wytworzeniem dwóch form anomerycznych [6]. Przejście z formy łańcuchowej do pierścieniowej wiąże się z powstaniem dodatkowego węgla asymetrycznego, zwanego anomerycznym, zaś formy α i β są zwane anomerami (Rys. 4). W roztworze wodnym formy α i β szybko przekształcają się wzajemnie poprzez otwartą formę łańcuchową do osiągnięcia stanu równowagi w mieszaninie. Zjawisko nosi nazwę mutarotacji. W trakcie ustalania stanu równowagi następuje zmiana skręcalności optycznej roztworu. Cukry, które zawierają w otwartej konfiguracji łańcuchowej wolną grupę aldehydową lub ketonową są zdolne do redukcji np. jonów miedziowych (Cu2+) do jonów miedziawych (Cu+), dlatego nadano im nazwę cukrów redukujących. Te właściwości stanowią podstawę 83

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

testowych reakcji, wykrywających cukry redukujące, takich jak reakcja Benedicta, Nylandera, Tollensa lub Barfoeda. Koniec redukujący takiego cukru jest zatem końcem zawierającym grupę aldehydową lub ketonową. Wśród istotnych cukrów prostych można wyróżnić m. in. fruktozę, mannozę, aldehyd glicerynowy (jeden z pośredników glikolizy i glukoneogenezy), ryboza i deoksyryboza (składniki kwasów nukleinowych), rybuloza (akceptor CO2 w cyklu Calvina) i glukoza (główny substrat energetyczny komórki). Typowymi oligosacharydami są disacharydy będące węglowodanami składającymi się z dwóch reszt monosacharydowych i połączonych ze sobą wiązaniem O-glikozydowym przez C1 aldozy lub C2 ketozy z grupą –OH drugiego cukru. Do disacharydów należą takie cukry jak:  maltoza (cukier słodowy) – złożona z dwóch reszt D-glukozowych powiązanych wiązaniem 1,4-α-glikozydowym  celobioza – jednostka strukturalna celulozy, złożona z dwóch reszt glukozowych powiązanych wiązaniem β-1,4-glikozydowym  laktoza (cukier mlekowy) – zbudowana z reszt D-galaktozy i D-glukozy, połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym  sacharoza (cukier trzcinowy lub buraczany) – złożona z reszty glukozy i fruktozy połączonych anomerycznym atomami węgla. Wiązanie glikozydowe ma konfigurację α dla glukozy i β dla fruktozy. Żaden z składowych monosacharydów nie może ulec zamianie w aldehyd lub keton, sacharoza nie zatem jest cukrem redukującym.

Rys. 3. Budowa cząsteczki sacharozy. Reszta D-glukozy i D-fruktozy połączone wiązaniem O-glikozydowym. Polisacharydy zbudowane są z wielu reszt monosacharydowych tworzących łańcuchy, które mogą być rozgałęzione. Można je podzielić na dwie grupy: wielocukrowce strukturalne oraz zapasowe. Do pierwszej grupy należą miedzy innymi: celuloza (podstawowy składnik ścian komórkowych roślin) i chityna (tworzy ściany komórkowe grzybów i pancerze stawonogów). Polisacharydami zapasowymi są np. skrobia (materiał zapasowy roślin), glikogen (materiał zapasowy zwierząt gromadzący się w mięśniach i wątrobie) i dekstran (materiał zapasowy bakterii i drożdży). Ilościowe oznaczenie węglowodanów można przeprowadzić na kilka sposobów:  metoda biologiczna – w wyniku fermentacji glukoza i fruktoza są ostatecznie przekształcane w alkohol etylowy i dwutlenek węgla  metody fizyczne – polegają na oznaczaniu ciężaru właściwego roztworu cukru lub jego skręcalności właściwej  metody chemiczne – szereg metod opartych na właściwościach redukujących cukrów  metody enzymatyczne – wykorzystują enzymy, które specyficznie przekształcają badaną cząsteczkę enzymu

84

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Spektrofotometria jest techniką pomiarową, u której podstaw ilościowego i jakościowego oznaczenia substancji w roztworze jest jej zdolność do pochłaniania (absorpcji) światła o określonej długości fali. Substancje bezbarwne mogą zostać spektrofotometrycznie oznaczone jeśli mają zdolność absorpcji w nadfiolecie (UV) lub można je przekształcić do pochodnych barwnych lub absorbujących w UV. Absorbancja (A) jest miarą ilości substancji. Prawo Lamberta-Beera mówi, że absorbancja światła monochromatycznego jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu (c) i grubości warstwy (l) – zwykle chodzi tu o grubość kuwety spektrofotometrycznej: A = εcl

(1)

gdzie: ε – molowy współczynnik absorbancji charakterystyczny dla danego związku. W analizie ilościowej stosuje się najczęściej serie roztworów związku chemicznego o znanym stężeniu (roztwory wzorcowe) w celu sporządzenia tzw. krzywej wzorcowej, która pozwala na porównywanie (w obrębie jej prostoliniowego przebiegu) absorbancji substancji badanej o nieznanym stężeniu z wartościami absorbancji roztworów wzorcowych. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest ilościowe oznaczenie i porównanie zawartości glukozy w peelingach cukrowych pochodzących od różnych producentach na podstawie metody chemicznej wykorzystującej właściwości redukujące cukrów polegającej na redukcji kwasu 3,5dinitrosalicylowego (DNS) w środowisku alkalicznym i w wysokiej temperaturze. Zakres materiału naukowego Peelingi, cukry proste i złożone, właściwości redukcyjne cukrów, mutarotacja, prawo Lamberta-Beera, spektrofotometria. Materiały dostarczane przez studentów Można przynieść dowolny peeling cukrowy Aparatura i szkło laboratoryjne Spektrofotometr UV-Vis, pH-metr, waga analityczna, pipety Pasteura, pipety szklane 1, 5, 10 i 25 ml, podpisane próbówki chemiczne, styropianowe statywy do probówek, statyw metalowy na probówki, cylindry miarowe 100 ml, zlewki 500 ml, kolbki miarowe 50 ml (5 sztuk), kolbka miarowa 100 ml, lejki, sączki, łaźnia wodna, łyżka metalowa, bagietka szklana. Odczynniki 5 M NaOH 5 M HCl 1% [w/v] roztwór kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w 0,4 M NaOH (rozpuścić 5 g w 500 ml 0,4 M NaOH) Roztwór podstawowy glukozy o stężeniu 18 mg/ml (rozpuścić 9 g w 0,5 l wody) Woda destylowana Wykonanie Przygotowanie krzywej wzorcowej i próbek 85

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Roztwory do krzywej wzorcowej: W kolbce na 100 ml odmierzyć 50 ml roztworu podstawowego glukozy o stężeniu 18 mg/ml i dopełnić do kreski wodą dejonizowaną. Zwartość kolbki dobrze wymieszać. Uzyskano w ten sposób roztwór roboczy glukozy o stężeniu 9 mg/ml, który posłuży do sporządzania kolejnych roztworów do krzywej wzorcowej metodą kolejnych rozcieńczeń. Do pięciu kolbek o pojemności 50 ml odmierzyć zgodnie z tabelą 1 objętości roztworu roboczego glukozy o stężeniu 9 mg/ml i dopełnić każda z nich woda destylowana do kreski miarowej. Zawartość dobrze wymieszać. Tabela 1. Sporządzanie roztworów wzorcowych. Objętość [ml] Numer wzorca roztworu roboczego glukozy o stężeniu 9 mg/ml 0 0 1 1 2 5 3 10 4 15 5 20

Stężenie glukozy [mg/ml] próba odniesienia 0,18 0,9 1,8 2,7 3,6

Do oznakowanych, zakręcanych probówek typu Falcon odmierzyć po 1 ml każdego z roztworów wzorcowych glukozy dodać do każdej z probówek po 1 ml kwasu 3,5dinitrosalicylowego i 5 ml wody destylowanej. Równolegle wykonać próbę odniesienia odmierzając do probówki 1 ml wody destylowanej, 1 ml kwasu 3,5-dinitrosalicylowego i 5 ml wody destylowanej. Zakręcić probówki i dokładnie wymieszać ich zawartość. Sześć przygotowanych probówek umieścić w styropianowych stojakach i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po wyjęciu probówek z łaźni wodnej i schłodzeniu ich zawartości zmierzyć dwukrotnie absorbancję na spektrofotometrze UV-Vis przy długości fali 550 nm. Spektrofotometr wyzerować na próbę odniesienia. Przygotowanie próbek Do probówek stożkowych (wirówkowych) typu Falcon o pojemności 50 ml odważyć około 0,4 0,5 g (z dokładnością 0,0001 g) dwóch różnych peelingów. Do każdej z próbek dodać 10 ml wody redestylowanej. Zawartość ujednorodnić poprzez energiczne mieszanie w ciągu 5 min. Następnie dodać 5 ml chloroformu. Powtórnie energicznie wytrząsać. Probówki umieścić w wirówce. Mieszaninę wirować przez 10 min przy 6000 rpm. Probówki ostrożnie umieścić w statywie. Należy zwrócić szczególna uwagę, aby obydwie warstwy były od siebie dobrze rozdzielone. Z każdej próbki pobrać po 5 ml warstwy wodnej (górnej) i przenieść do czystych i suchych probówek typu Falcon o pojemności 15 ml. Do każdej dodać 0,5 ml 5 M roztworu HCl. Probówki zakręcić, ujednorodnić i umieścić w styropianowym pływaku w łaźni wodnej w temperaturze 85oC na 10 min. Po tym czasie probówki ochłodzić w zimnej wodzie. Następnie dodać 0,5 ml 5 M roztworu NaOH. Zawartość probówek powtórnie wymieszać. Pobrać 1 ml roztworu i przenieść do kolejnej probówki (sucha i czysta) typu Falcon. Dodać 1 ml 1% roztworu kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w 0,4 M NaOH. Zawartość probówek energicznie wymieszać. Następnie dodać 5 ml wody destylowanej. Powtórnie zawartość probówek ujednorodnić, umieścić w styropianowym pływaku w łaźni wodnej w temperaturze 85 oC na 5 min. Po tym czasie próbówki ochłodzić w zimnej wodzie. Przeprowadzić pomiar absorbacji dla każdej z badanych próbek na spektrofotometrze UV-Vis przy długości fali 550 nm. Spektrofotometr wyzerować na próbę odniesienia. Jeżeli absorbancja wyniesie 0,8 wówczas próbki należy rozcieńczyć. 86

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Omówienie wyników 1. Wykreślić zależność stężenia od absorbancji. Wyznaczyć zależność liniową (równanie zależności liniowej, współczynnik korelacyjny prostej). 2. Na podstawie powyższej zależności obliczyć zawartość glukozy w badanych preparatach kosmetycznych po uwzględnieniu kolejnych rozcieńczeń. Literatura 1. J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer: Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009 2. M. Droba, B. Droba, M. Balawejder: Biochemia z elementami enzymologii. Ćwiczenia laboratoryjne. Wydawnictwo Uniwersytetu Rzeszowskiego, Rzeszów 2012 3. J. Walory, M. Pilarek, M. Kalinowska, H. Jaworowska-Deptuch. Biochemia. Ćwiczenia laboratoryjne. Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa 2010 4. D. Hames, N. Hooper. Krótkie wykłady. Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2010 5. R. Derlacz i in.: Biochemia - Podstawy biochemii dla ochrony środowiska. Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii Instytut Biochemii, Warszawa 2009 6. https://teaching.ncl.ac.uk/bms/wiki/images/a/a1/D-glucose.jpg 7. http://www.chemistryexplained.com/Bo-Ce/Carbohydrates.html 8. http://www.ekologia.pl/wiedza/slowniki/leksykon-ekologii-i-ochronysrodowiska/sacharoza

87

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

ĆWICZENIE 12 IZOLOWANIE DETERGENTÓW Z PŁATKÓW DO DEMAKIJAŻU I ŻELI ZA POMOCĄ EKSTRAKCJI CIECZ-CIECZ I IDENTYFIKACJA ZA POMOCĄ SPEKTROFOTOMETRII UV-VIS Wstęp

Spektrofotometria absorpcyjna opiera się na selektywnej absorpcji promieniowania świetlnego poprzez roztwór badanej substancji. Ze względu na wykorzystany zakres widma rozróżnia się spektrofotometrię w nadfiolecie (UV – z ang. Ultra Violet), w świetle widzialnym (VIS – z ang. VISible) i w podczerwieni (IR - z ang. Infra Red). Podstawą spektroskopii absorpcyjnej stanowią prawa Bougera-Lamberta i Beera. Rozpatrzmy wiązkę promieniowania monochromatycznego (o określonej długości fali ) o natężeniu I0, padającą na warstwę roztworu, o grubości l, znajdują się w kuwecie. Padające promieniowanie jest częściowo pochłonięte (Ia), częściowo odbite od ścian kuwety lub rozproszone (Ir), a reszta przechodzi przez próbkę (It). Można to przedstawić równaniem I 0 = Ia + I r + It

(1)

W przypadku roztworów nie zawierających zawiesin promieniowanie Ir jest niewielkie (< 4%) i można je pominąć. Stosuje się wtedy równanie: I0 = Ia + It (2) Wiązka promieniowania, przechodząc przez jednorodny ośrodek o grubości l, ulega osłabieniu, zgodnie z równaniem Lamberta: (3) I t  I 0e  kl gdzie: k - współczynnik absorpcji charakterystyczny dla danej substancji, e - podstawa logarytmów naturalnych. Zależność tę można zapisać w inny sposób: I (4) log 0  Kl  A It Gdzie: K - 2,303 k; A - zdolność pochłaniania zwana absorbancją. Inne terminy to: wartość absorpcji, ekstynkcja (E) lub gęstość optyczna (D). Wyrażenie It/I0 nazywamy przepuszczalnością lub transmitancją T wyrażoną zwykle w procentach: I (5) T  t 100% I01 (6) A  log  100% T Zależność między natężeniem promieniowania It a stężeniem substancji (c) w roztworze, przez który promieniowanie przechodzi, określa prawo Beera: I t  I 0 e  k 'c (7) czyli I t  II0 e cl (8) 0 A  log  cl (9) t gdzie:  - molowy współczynnik absorpcji,I gdy stężenie wyrażone jest w mol/dm3. Równanie powyższe wyraża podstawowe prawo spektrofotometrii absorpcyjnej roztworów – prawo Lamberta-Beera. Współczynnik absorpcji nie zależy od stężenia, zależy natomiast od długości fali światła padającego, rodzaju substancji absorbującej i temperatury roztworu. Absorbancja A zależy od stężenia roztworu, a funkcja A = f(c) jest linią prostą, jeżeli roztwór spełnia prawo Beera. 88

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Błędy metod spektrofotometrii absorpcyjnej W przypadku spełnienia prawa Beera zależność A = f(c) jest prostą przechodzącą przez początek układu współrzędnych. Przebieg zależności wykazujący odchylenia od prawa może być spowodowany albo zmianami chemicznymi roztworu zachodzącymi w miarę wzrostu stężenia, albo warunkami pomiaru. Chemiczne odstępstwa mogą być wynikiem reakcji polimeryzacji albo kondensacji cząsteczek lub jonów absorbujących, reakcji między jonami absorbującymi i rozpuszczalnikiem lub dodatkowymi reakcjami między poszczególnymi składnikami roztworu. Nie spełniają na ogół prawa Lamberta-Beera układy barwne, w których zachodzi stopniowe tworzenie kompleksów. Odstępstwa są również wynikiem stosowania niewystarczająco monochromatycznego promieniowania. Najmniejszy błąd podczas pomiarów absorpcjometrycznych popełnia się, gdy absorbancja A = 0,3 – 0,7 (T = 20 – 50%). Z prawa absorpcji można obliczyć, że dla A = 0,4343 (T = 36,8%) błąd względny, czyli stosunek A/A ma wartość najmniejszą. Spektrofotometria absorpcyjna w świetle widzialnym (VIS) i nadfiolecie (UV) Wrażenie barwy substancji, jakiego doznaje się w widzialnym zakresie widma, jest związane z selektywnym pochłanianiem promieniowania o określonej długości fali. Jeżeli promieniowanie nie zostaje pochłonięte, substancja przezroczysta wywołuje wrażenie bezbarwności. Barwa substancji zależy od jej budowy, a ściśle - od struktury elektronowej atomu i rozmieszczenia elektronów w cząsteczce (ugrupowaniu atomów). W związkach organicznych przyczyną selektywnej absorpcji promieniowania jest niedobór elektronów i związana z tym deformacja struktury elektronowej cząsteczki. Związki nasycone nie wykazują selektywnej absorpcji, związki z jednym podwójnym wiązaniem absorbują w dalekim nadfiolecie. Cały sprzężony układ elektronów w cząsteczce nazywa się jej chromoforem (niosący barwę). Intensywność barwy związku zależy od rodzaju przyłączonego podstawnika, czyli od obecności tzw. grup auksochromowych (–Br, –Cl, CH3, –NH2, –OH,–OCH3). Metody spektrofotometryczne należą do najczęściej stosowanych w analizie ilościowej. Charakteryzują się następującymi zaletami: 1. Dobrą czułością - czułość to wartość stężenia substancji dla A = 0,05 i l = 1 cm. 2. Dobrą precyzją - termin precyzja oznacza powtarzalność i zgodność otrzymanych wyników. 3. Selektywnością (wybiórczością oznaczeń). Wybiórczość metod spektrofotometrycznych jest uwarunkowana selektywnością absorpcji promieniowania UV i selektywnością odczynników wywołujących barwną reakcję z oznaczaną substancją. Na selektywność barwnych reakcji można wpływać m.in. przez zmianę wartościowości niektórych jonów metali, zmianę pH środowiska reakcji, a przede wszystkim przez stosowanie odczynników maskujących substancje przeszkadzające. W analizie ilościowej metodą spektrofotometrii UV-VIS stosuje się następujące rodzaje absorpcji: 1. Absorpcja w nadfiolecie stosowana do oznaczania węglowodorów aromatycznych i innych związków organicznych, 2. Absorpcja w świetle widzialnym stosowana do oznaczeń barwnych soli nieorganicznych oraz związków organicznych. Środki powierzchniowo czynne Detergenty są podstawowym składnikiem wielu środków czystości. Są to związki chemiczne posiadające w cząsteczce długi łańcuch hydrofobowy oraz grupę polarną 89

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

(hydrofilową). Dzięki takiej budowie mogą gromadzić się na granicy faz zmniejszając napięcie powierzchniowe rozpuszczalnika. Mydła, czyli sole sodowe lub potasowe wyższych kwasów tłuszczowych (posiadających grupę karboksylową), tracą swoje właściwości w wodach twardych ze względu na tworzenie się nierozpuszczalnych soli wapnia i magnezu. Detergenty ze względu na charakter grup polarnych np. sulfonowych zachowują skuteczność także w wodzie twardej. Są one jednak zdecydowanie w mniejszym stopniu biodegradowalne niż mydła. Środki powierzchniowo czynne (ŚPC) ze względu na typ grupy polarnej dzieli się na anionowe, kationowe i niejonowe. Podział wraz z klasami toksyczności przedstawia się następująco: 1. anionowe  alkiloarylosulfoniany  siarczany alkoholi tłuszczowych – IV  siarczanowe produkty oksyetylenowane  sulfobursztyniany, sulfonowane oleje  mydła sodowe i potasowe kwasów stearynowego i palmitynowego – V 2. kationowe  czwartorzędowe związki amoniowe – III  czwartorzędowe związki pirydyniowe 3. niejonowe  alkilo-, alkilofenylo-polietylenoglikole  estry kwasów tłuszczowych z alkoholami wielowodorotlenowymi – V-VI ŚPC z wyjątkiem kationoaktywnych charakteryzują się niewielką toksycznością (IV klasa) bądź są praktycznie nietoksyczne (V-VI klasa). Detergenty kationowe zakwalifikowano do III klasy toksyczności co oznacza, że są to substancje toksyczne, a prawdopodobna dawka śmiertelna dla dorosłego człowieka to ok. 4 g. Poza toksycznością związaną z bezpośrednim spożyciem, duże problemy stwarza obecność ŚPC w wodach i ściekach. Ich występowanie w ściekach i wodach powierzchniowych wiąże się z ich szerokim zastosowaniem w wielu gałęziach przemysłu i gospodarstwie domowym. Spotyka się je często w ściekach bytowo-gospodarczych, pralniczych, przemysłu włókienniczego, papierniczego, garbarskiego, tytoniowego, kosmetycznego itp. Ze względu na zdolność do tworzenia trwałej piany mogą utrudniać pracę oczyszczalni ścieków lub zakłócać procesy samooczyszczania wód. Najwyższe dopuszczalne stężenie detergentów anionowych w wodzie do picia wynosi 0,2 mg/dm3, kationowych 0,1 mg/dm3, a niejonowych 0,2 mg/dm3. Natomiast dopuszczalna zawartość detergentów anionowych i niejonowych w wodach powierzchniowych wynosi odpowiednio: dla I klasy czystości 0,2 i 0,5 mg/dm3, dla II klasy 0,5 i 1,0 mg/dm3, a dla III klasy 1,0 i 2,0 mg/dm3. Oznaczanie detergentów anionoaktywnych metodą z błękitem metylenowym Próbkę wody do oznaczenia anionowych substancji powierzchniowo czynnych pobiera się do naczynia szklanego. Oznaczenie należy wykonać nie później niż po 4 godzinach od pobraniaN próbki. W innym przypadku należy próbkę utrwalić dodając kwas siarkowy(VI) do pH < 2 lub 3–4 cm3 chloroformu na 1 dm3 ścieku, a następnie C H C l HC + N S przechowywaćN ją w temperaturze 4–5C. CH CH ( 10) Zasada oznaczenia polega na tworzeniu się zabarwionego na niebiesko produktu reakcji błękitu metylenowego (wzór 10) (chlorek 3,6-bis-dimetyloaminofenotiazonowy) z 3

3

3

3

90

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

anionoaktywną substancją powierzchniowo czynną. Powstające sole są dobrze rozpuszczalne w chloroformie a intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia ŚPC. Oznaczenie przeprowadza się spektrofotometrycznie przy  = 652 nm. Metoda ta ma zastosowanie w zakresie stężeń od 0,025 do 100 mg/dm3 ŚPC. W oznaczeniu przeszkadzają (zawyżają wynik) wszystkie te związki, które dają połączenia z błękitem metylenowym, np. organiczne siarczany, sulfoniany, fosforany, fenole, cyjaniany, chlorki, azotany, rodanki. Z tego względu wynik oznaczenia można podać jako „substancje reagujące z błękitem metylenowym”. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie z metodyką oznaczania anionoaktywnych substancji powierzchniowo czynnych w płatkach do demakijaży i żelach poprzez ich wyizolowanie metodą ekstrakcji ciecz-ciecz i oznaczenie metodą spektrofotometryczną. Zakres materiału naukowego Ekstrakcja ciecz-ciecz, prawo podziału, spektrofotometria – ugrupowania chromoforowe, grupy auksochromowe, prawo Lamberta-Beera i odchylenia o niego, krzywa wzorcowa, budowa spektrofotometru. Struktura i podział środków powierzchniowo czynnych. Aparatura i szkło laboratoryjne Spektrofotometr + kuwety; rozdzielacze 500 cm3 i 250 cm3; zlewka 250 cm3; bagietka; statyw, łapy (2 szt.); łączniki (2 szt.); kolba miarowa 50 cm3; mały lejek; pipety wielomiarowe na 5 cm3 (2 szt.); pipeta jednomiarowa100 cm3; cylinder 25 cm3 (2 szt.); cylinder 50 cm3; kolba miarowa 100 cm3. Odczynniki Roztwór błękitu metylenowego (Rozpuścić 100 mg błękitu metylenowego w 100 cm3 wody destylowanej. Przenieść 30 cm3 tego roztworu do kolby miarowej o pojemności 1 dm3. Dodać 500 cm3 wody detylowanej, 6,8 cm3 kwasu siarkowego(VI) (d=1,84 g/cm3) i 50 g diwodoroortofosforanu(V) sodu. Wstrząsać do rozpuszczenia odczynników. Dopełnić wodą destylo3waną do kreski), fenoloftaleina, roztwór 1 %; trichlorometan (chloroform -CHCl3) cz.d.a.; 1 mol/dm3 roztwór zasady sodowej; 1 mol/dm3 roztwór kwasu siarkowego(VI); roztwór do przemywania (NaH2PO4+H2SO4+H2O – Do 500 cm3 wody destylowanej dodać 6,8 cm3 kwasu siarkowego(VI) (d=1,84 g/cm3) i 50 g diwodoroortofosforanu(V) sodu, wytrząsać do rozpuszczenia. Dopełnić wodą do kreski); dodecylosiarczan sodu – roztwór o stężeniu 0,1 mg/cm3, płatki do demakijażu Przygotowanie krzywej wzorcowej – nie wykonuje student 1. Przygotować 1 dm3 roztworu podstawowego substancji anionoaktywnej, np. dodecylosiarczanu sodowego (SDS) poprzez rozpuszczenie 0,100 g SDS w wodzie destylowanej i uzupełnienie wodą do kreski. Roztwór ten zawiera 0,1 mg substancji w 1 cm3. 2. W dniu wykonania oznaczenia przygotować wzorcowy roztwór roboczy przez rozcieńczenie 10 cm3 roztworu wzorcowego podstawowego wodą destylowaną w kolbie miarowej na 100 cm3. Roztwór ten zawiera 0,01 mg substancji w 1 cm3. 3. Do szeregu rozdzielaczy odmierzyć następujące ilości wzorcowego roztworu roboczego: 0,0; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0, 7,5; 10,0; 15,0; 20,0 cm3 (odpowiada to następującym ilościom SDS w próbce: 0,000; 0,005; 0,010; 0,025; 0,050; 0,075; 0,100; 0,150; 0,200 mg). Dopełnić wodą destylowaną do 100 cm3 i poddać wzorce takiej samej obróbce jak próbę badaną. Po 91

Zaawansowana Analiza w Chemii Kosmetycznej Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

zmierzeniu absorbancji na spektrofotometrze wykreślić krzywą wzorcową A = f(awz), gdzie A - absorbancja awz – zawartość substancji powierzchniowo czynnej dla poszczególnych wzorców w mg. Wyznaczyć równanie krzywej wzorcowej i w oparciu o nie wykonać obliczenia. Wykonanie Na wadze analitycznej zważyć płatek do demakijażu. Podzielić go na cztery części i dwie z nich zważyć z dokładnością do 0,000 g w osobnych zlewkach. Ćwiartkę płatka umieścić w zlewce i zalać 50 ml wody destylowanej. Po wymieszaniu roztwór przenieść do rozdzielacza, a pozostałość w zlewce ekstrahować ponownie 50 ml wody. Połączyć oba ekstrakty w rozdzielaczu do badanej próbki zalkalizować roztworem NaOH (1 mol/dm3) wobec fenoloftaleiny do lekko różowego zabarwienia. Dodawać kroplami 1 mol/dm3 roztwór H2SO4 do zaniku barwy. Do mieszaniny dodać 10 cm3 chloroformu i 25 cm3 roztworu błękitu metylenowego. Wytrząsać około 30 sekund, po czym warstwę chloroformową (dolną) przenieść do drugiego rozdzielacza. Ekstrakcję powtórzyć jeszcze 2 razy, używając po 10 cm 3 chloroform. Zebrane ekstrakty chloroformowe (30 cm3) przemyć 50 cm3 roztworem do przemywania wytrząsając energicznie w ciągu 30 sekund. Po rozdzieleniu się, warstwę chloroformową przesączyć przez zwitek waty do kolbki miarowej na 50 cm3. Pozostałość w rozdzielaczu wytrząsać z 10 cm3 chloroformu i warstwę chloroformową przenieść do tej samej kolbki miarowej. Zawartość kolbki dopełnić do kreski czystym chloroformem, wymieszać i zmierzyć absorbancję przy  = 652 nm względem czystego chloroformu jako roztworu odniesienia. Jeżeli absorbancja przekroczy wartość 0,9, próbkę należy rozcieńczyć i dokładnie wymieszać. Przeprowadzić trzykrotny pomiar absorbancji. Współczynnik rozcieńczenia uwzględnić przy końcowych obliczeniach. W identyczny sposób postępować z próbką żelu. Naważka powinna być zawierać się w przedziale od 0,2 – 0,4 g, Z krzywej wzorcowej odczytać zawartość substancji anionoaktywnej w wodzie, a jej stężenie obliczyć ze wzoru: a X [mg / dm 3 ] (11) Vpr gdzie: a – zawartość substancji anionoaktywnej w badanej próbce (odczyt z krzywej wzorcowej) [mg]; Vpr – objętość próbki wody użytej do oznaczania [dm3]. 4.5. Literatura 1. P. O’Neill, Chemia środowiska, Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa-Wrocław 1997. 2. W. Seńczuk (red.), Toksykologia, PZWL Warszawa 1994. 3. W. Hermanowicz, J. Dojlido, W. Dożańska, B. Koziorowski, J. Zerbe, Fizyczno-chemiczne badanie wody i ścieków, Arkady, Warszawa 1999. 4. J. Minczewski, Z. Marczenko, Chemia analityczna, t. 2 i 3, PWN, Warszawa 1976.

92