Sprawozdanie 1 - final

Ćwiczenia z metod fizycznych w biologii (16.11.11)

Sprawozdanie nr. 1 – Spektrofotometria

Sprawozdanie wykonane przez:

    

Sandra Junik Paulina Karpeta Nikodem Kubicz Ariel Makarowicz Kamil Senderowski

Kierunek – Biotechnologia Rok akademicki – 2011/12 Semestr – I Potok – II Grupa Ćwiczeniowa – 3A

Spis Treści:  str. 3-7  str. 3  str. 4

-

 str. 6

-

 str. 8-14  str. 9

-

 str. 10

-

 str. 11

-

 str. 12

-

 str. 13

-

 str. 15-20  str. 16

-

 str. 17

-

 str. 18

-

 str. 19

-

 str. 19

-

 str. 21

-

Zadanie nr. 1 - Ćwiczenie nr. 10.4.1. Tabela 1.1: Skład ilościowy badanych próbek Tabela 1.2: Końcowe stężenia DCIP na podstawie absorpcji przy fali długości 600 nm Wykres 1.1: Zależność absorpcji przy λ=600 nm od wartości stężenia DCIP [μM] Zadanie nr. 2 - Ćwiczenie nr. 10.4.2.2 - Wpływ pH na parametry spektralne związków Tabela 2.1: Skład chemiczny i ilościowy oraz pH badanych próbek Tabela 2.2: Wartość absorpcji próbek przy długościach fali świetlnych od 300 do 800 nm Wykres 2.1: Wpływ pH na parametry spektralne związków chemicznych Tabela 2.3: Wartość absorpcji próbek dla fali świetlnej o długości 565 nm Wykres 2.2: Krzywa zależności absorpcji czerwieni fenolowej dla długości fali 565 nm od pH Zadanie nr. 2 - Ćwiczenie nr. 10.4.3 – Spektrofotometryczna analiza jakościowa Tabela 3.1: Wartość absorpcji próbek przy długościach fali świetlnych od 300 do 800 nm Wykres 3.1: Zależność wartości absorpcji próbek od długości fali świetlnej Tabela 3.2: Zależność absorpcji Próbki X od długości fali świetlnej Wykres 3.2: Zależność wartości absorpcji Próbki X od długości fali świetlnej Wykres 3.3: Zależność wartości absorpcji Próbki X oraz jej składowych od długości fali świetlnej Zadanie nr. 4 – Zadanie dodatkowe

Zadanie nr. 1 - Ćwiczenie nr. 10.4.1. - Wyznaczanie stężenia roztworu na podstawie prawa Lamberta - Beera A. Cel doświadczenia: Zapoznanie z praktycznym wykorzystaniem prawa Lamberta – Beera do wyznaczania stężenia substancji w roztworze. Doświadczenie ma również na celu zapoznanie z reprezentacją graficzną widma w funkcji stężenia.

B. Materiały i odczynniki użyte w doświadczeniu: 

10 probówek szklanych



kuweta spektrofotometryczna plastikowa długości 1cm



spektrofotometr



pipeta automatyczna o zakresie 1-5 ml



woda destylowana



50 ml 100μM roztworu DCIP

C. Przebieg doświadczenia: 1) Do wykonania ćwiczenia konieczne było przygotowanie po 10 ml roztworów DCIP (dichlorofenyloindofenolu) o różnych stężeniach z roztworu pierwotnego o stężeniu 100 μM. Roztwory sporządziłem zgodnie z poniższą tabelą: Tabela 1.1: Skład ilościowy badanych próbek Nr probówki

Objętość 100 μM DCIP [ml]

H2O [ml]

1

1

9

2

2

8

3

3

7

4

4

6

5

5

5

6

6

4

7

7

3

8

8

2

9

9

1

10

10

0

2) Po sporządzeniu wyżej wymienionych roztworów przystąpiłem do pomiarów na spektrofotometrze. Zanim jednak to uczyniłem wyzerowałem urządzenie pomiarowe. W tym celu do kuwety spektrofotometrycznej nalałem 2/3 objętości

wody

destylowanej,

która

była

moim

rozpuszczalnikiem,

i

skalibrowałem urządzenie, tzn. ustawiłem wartość absorpcji przy długości fali 600nm na 0.

3) Kolejno wykonałem trzy serie powtórzeń, zaczynając pomiary od roztworu o najmniejszym stężeniu. Uzyskane wyniki przedstawia tabela poniżej. Tabela 1.2: Końcowe stężenia DCIP na podstawie absorpcji przy fali długości 600nm

A600

Końcowe

Odchylenie

teoretyczne stężenie

standardowe

DCIP [μM]

Końcowe stężenie DCIP wyznaczone na podstawie A600 [μM]

A1

A2

A3

Aśrednie

10

-0,004

-0,009

0,001

0,001

0,005

0,062111801

20

0,006

0,004

0,003

0,004

0,001527525

0,248447205

30

0,017

0,010

0,015

0,014

0,003605551

0,869565217

40

0,023

0,023

0,027

0,024

0,002309401

1,49068323

50

0,039

0,034

0,032

0,035

0,003605551

2,173913043

60

0,034

0,042

0,034

0,036

0,004618802

2,236024845

70

0,043

0,046

0,049

0,046

0,003

2,857142857

80

0,051

0,057

0,053

0,054

0,00305505

3,354037267

90

0,066

0,068

0,072

0,068

0,00305505

4,223602484

100

0,071

0,073

0,080

0,075

0,004725816

4,658385093

*Wyjaśnienie dotyczące wyników otrzymanych w tabeli.

a) Obliczanie stężenia teoretycznego:

10-4 mola DCIP – 1000 ml x

- 1 ml

x= 1,0 * 10-7 mola C1=

1,0 * 10 7 mola =1,0 *10-5 M = 10μM 0,01l

b) Obliczanie stężenia końcowego na podstawie absorpcji przy fali długości

600nm: Obliczenia wykonujemy zgodnie z prawem Lamberta- Beera. Molowy współczynnik absorpcji dla DCIP przy λ=600 nm wynosi ε=16100 dm3/mol*cm A= C* ε* l C – stężenie molowe l – długości drogi optycznej (grubość kuwety) ε=16100 dm3/mol*cm Przekształcając wzór na prawo Lamberta- Beera otrzymałem: C=

A  *l

Zgodnie z tym wzorem obliczałem kolejne stężenia. C=

A  *l

C1=

0,001  6,21*10-8 M=6,21 * 10-2μM 16100 * 1

c) Odchylenie standardowe zostało policzone ze wzoru: 2 n s x2  x n 1





Gdzie: n – liczba wyników w próbie x – średnia arytmetyczna z próby

x 2 - średnia arytmetyczna kwadratów wartości z próby

4) Wyniki

przedstawione

w

tabeli

sporządziłem

w

formie

wykresu

przedstawiającego zależność stężenia DCIP od absorpcji średniej przy długości fali równej 600nm.

Wykres 1.1:

Absorpcja promieniowania

Zależność absorpcji przy λ=600nm od wartości stężenia DCIP [μM] 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 -0,01 0

y = 0,0161x + 2E-17 2 R =1

1

2

3

4

5

C roztowu [μM]

D. Wnioski:

Wyniki teoretyczne znacznie różnią się od wyników pomiarowych. Stężenia roztworów

teoretycznych

są

blisko

21,5

razy

większe

niż

stężenia

przygotowanych roztworów pomiarowych. Tak duża różnica wynika z błędu jaki został popełniony podczas przygotowywania roztworu wyjściowego 100 μM. Przyjąłem do obliczeń stężenie roztworu wyjściowego jako 100 μM, podczas gdy jego faktyczne stężenie teoretyczne było blisko 20 razy mniejsze, dlatego otrzymałem tak wielką różnicę porównując stężenia teoretyczne z stężeniami prób przygotowanych przez pipetowanie odpowiednich objętości. Doświadczenie miało na celu pokazanie jak można doświadczalnie obliczyć nieznane stężenie roztworu przy pomocy pomiarów spektrofotometrycznych. Na

podstawie wykresu i wyznaczonego równania możemy wyliczyć dowolne stężenie roztworu. Wykres przedstawiający tę zależność powinien rosnąć liniowo. Tak też się dzieje w przypadku wykresu, który otrzymałem na podstawie moich pomiarów. Różnice w wynikach pomiarów dla kolejnych trzech serii wynikają z dokładności spektrofotometru. Jako, że za każdym razem nie przepłukiwałem kuwety spektrofotometrycznej rozpuszczalnikiem stężenie mogło się minimalnie zmieniać w kolejnych pomiarach, ponieważ spektrofotometr jest bardzo czuły nawet na najmniejsze zmiany stężenia. Wyznaczenie współczynnika korelacji liniowej (R2) umożliwia nam określenie poziomu zależności liniowej od zmiennych losowych. Im kwadrat odległości punktów pomiarowych od linii trendu jest mniejszy, tym bardziej punkty te układają się na linii prostej. W związku z tym wartość współczynnika korelacji R2 jest

bliższa

jedności.

W

doświadczeniu,

które

wykonałem

wyznaczony

współczynnik korelacji wynosi dokładnie 1, co oznacza, że pomiary zostały wykonane precyzyjnie a zależność absorpcji od stężenia na wykresie układa się idealnie liniowo.

Zadanie nr. 2 - Ćwiczenie nr. 10.4.2.2 - Wpływ pH na parametry spektralne związków A. Cel doświadczenia: Zbadanie i przedstawienie jak pH związku chemicznego w roztworze rozpuszczalnika wpływa na jego właściwości spektralne, szczególnie w przypadku wskaźników kwasowo-zasadowych jak czerwień fenolowa.

B. Materiały i odczynniki użyte w doświadczeniu:             

8 probówek szklanych kuweta spektrofotometryczna plastikowa o długości 1cm spektrofotometr 2 pipety automatyczne – o zakresie 100-1000 μl oraz od 1-5 ml woda destylowana 0.1% (w/w) czerwieni fenolowej 0.2 M roztwór CH3COOH 0.2 M roztwór CH3COONa 0.1 M roztwór KOH 0.1 M roztwór HCl 50 mM roztwór Na2B4O7 66 mM roztwór KH2PO4 66 mM roztwór Na2HPO4

C. Przebieg doświadczenia: 1) Do doświadczenia wykorzystaliśmy wcześniej przygotowany roztwór czerwieni fenolowej o stężeniu 0.1% (w/w). 2) Przygotowaliśmy 8 próbek badawczych według poniższych instrukcji: 













Próbka 1: Do 3 ml 50 mM roztworu Na2B4O7 dodaliśmy 2 ml 0.1 M roztworu KOH i 150 μl roztworu czerwieni fenolowej Próbka 2: Do 4.25 ml 50 mM roztworu Na2B4O7 dodaliśmy 0.75 ml 0.1 M roztworu HCl i 150 μl roztworu czerwieni fenolowej Próbka 3: Do 2.75 ml 50 mM roztworu Na2B4O7 dodaliśmy 2.25 ml 0.1 M roztworu HCl i 150 μl roztworu czerwieni fenolowej Próbka 4: Do 2 ml 66 mM roztworu KH2PO4 dodaliśmy 3 ml 66 mM roztworu Na2HPO4 i 150 μl roztworu czerwieni fenolowej Próbka 5: Do 2.5 ml 66 mM roztworu KH2PO4 dodaliśmy 2.5 ml 66 mM roztworu Na2HPO4 i 150 μl roztworu czerwieni fenolowej Próbka 6: Do 3.5 ml 66 mM roztworu KH2PO4 dodaliśmy 1.5 ml 66 mM roztworu Na2HPO4 i 150 μl roztworu czerwieni fenolowej Próbka 7: Do 4.5 ml 66 mM roztworu KH2PO4 dodaliśmy 0.5 ml 66 mM roztworu Na2HPO4 i 150 μl roztworu czerwieni fenolowej



Próbka 8: Do 1.5 ml 0.2 M roztworu CH3COOH dodaliśmy 3.5 ml 0.2 M roztworu CH3COONa i 150 μl roztworu czerwieni fenolowej

Tabela 2.1: Skład chemiczny i ilościowy oraz pH badanych próbek Nr probówki

Odczynnik A

Ilość A [ml]

Odczynnik B

Ilość B [ml]

Czerwień fenolowa [ml]

pH

50 mM Na2B4O7 50 mM Na2B4O7 50 mM Na2B4O7

3

0.1 M KOH

2

150 μl

9.97

4.25

0.1 M HCl

0.75

150 μl

9.01

2.75

0.1 M HCl

2.25

150 μl

7.94

4

66 mM KH2PO4

2

3

150 μl

6.98

5

66 mM KH2PO4

2.5

2.5

150 μl

6.81

6

66 mM KH2PO4

3.5

1.5

150 μl

6.47

7

66 mM KH2PO4

4.5

0.5

150 μl

5.91

8

0.2 M CH3COOH

1.5

3.5

150 μl

5.00

1 2 3

66 mM Na2HPO4 66 mM Na2HPO4 66 mM Na2HPO4 66 mM Na2HPO4 0.2 M CH3COONa

3) Przed rozpoczęciem pomiarów przygotowaliśmy spektrofotometr przez ustawienie zakresu długości badanych fal od 300 do 800 nm oraz używając kuwety napełnionej wodą destylowaną (rozpuszczalnik) do 2/3 objętości ustawiliśmy wartość absorpcji wskazywaną przy pomiarze na wartość 0. 4) Dokonaliśmy pomiaru spektrofotometrem absorpcji w zakresie długości fal od 300 do 800 nm dla każdej wcześniej przygotowanej próbki. Doświadczenie to nazywa się absorpcyjną analizą spektralną. Absorpcyjna analiza spektralna – pomiar przepuszczalności lub absorpcji promieniowania roztworu badanego w funkcji długości fali świetlnej Przy każdym pomiarze wcześniej wyczyszczoną kuwetę wypełnialiśmy w 2/3 objętości roztworem badanej próbki, po czym umieszczaliśmy ją w spektrofotometrze i dokonywaliśmy pomiaru. Wyniki otrzymywaliśmy w postaci wydruku. Po każdym pomiarze kuwetę przemywaliśmy wodą destylowaną. Powyższe czynności powtórzyliśmy dla każdej próbki.

Długość fali [nm]

Absorpcja próbki 1

Absorpcja próbki 2

Absorpcja próbki 3

Absorpcja próbki 4

Absorpcja próbki 5

Absorpcja próbki 6

Absorpcja próbki 7

Absorpcja próbki 8

Długość fali [nm]

Absorpcja próbki 1

Absorpcja próbki 2

Absorpcja próbki 3

Absorpcja próbki 4

Absorpcja próbki 5

Absorpcja próbki 6

Absorpcja próbki 7

Absorpcja próbki 8

Tabela 2.2: Wartość absorpcji próbek przy długościach fali świetlnych od 300 do 800 nm

300 305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360 365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420 425 430 435 440 445 450 455 460 465 470 475 480 485 490 495 500 505 510 515 520 525 530 535 540 545 550

0,602 0,465 0,365 0,305 0,282 0,281 0,292 0,309 0,333 0,363 0,398 0,42 0,425 0,4 0,344 0,271 0,197 0,123 0,093 0,076 0,073 0,078 0,087 0,1 0,111 0,127 0,149 0,174 0,201 0,23 0,261 0,301 0,344 0,39 0,451 0,505 0,577 0,665 0,75 0,853 0,959 1,027 1,11 1,218 1,308 1,382 1,443 1,492 1,537 1,57 1,593

0,569 0,447 0,354 0,299 0,277 0,277 0,287 0,302 0,325 0,353 0,385 0,408 0,412 0,391 0,339 0,272 0,202 0,136 0,109 0,095 0,094 0,1 0,111 0,125 0,136 0,152 0,174 0,198 0,223 0,25 0,279 0,314 0,353 0,395 0,451 0,501 0,566 0,647 0,727 0,822 0,92 0,983 1,061 1,164 1,251 1,325 1,385 1,435 1,483 1,518 1,543

0,785 0,618 0,504 0,436 0,41 0,41 0,421 0,438 0,465 0,499 0,538 0,568 0,577 0,557 0,502 0,424 0,344 0,272 0,245 0,237 0,247 0,266 0,29 0,316 0,337 0,364 0,395 0,426 0,457 0,487 0,518 0,55 0,591 0,635 0,693 0,746 0,815 0,9 0,982 1,08 1,171 1,205 1,247 1,319 1,375 1,416 1,447 1,473 1,497 1,517 1,534

0,39 0,346 0,33 0,318 0,313 0,307 0,303 0,296 0,29 0,29 0,3 0,32 0,343 0,377 0,414 0,451 0,487 0,586 0,631 0,692 0,755 0,808 0,859 0,901 0,927 0,952 0,968 0,972 0,963 0,944 0,915 0,854 0,805 0,753 0,686 0,63 0,565 0,497 0,444 0,395 0,357 0,333 0,314 0,304 0,304 0,31 0,323 0,344 0,377 0,417 0,46

0,355 0,319 0,309 0,301 0,297 0,293 0,288 0,279 0,271 0,269 0,275 0,294 0,315 0,349 0,389 0,427 0,464 0,552 0,595 0,651 0,706 0,754 0,798 0,836 0,858 0,879 0,895 0,9 0,895 0,88 0,857 0,793 0,751 0,705 0,644 0,592 0,53 0,463 0,409 0,359 0,318 0,287 0,263 0,247 0,238 0,237 0,242 0,253 0,273 0,299 0,327

0,349 0,318 0,312 0,306 0,303 0,298 0,291 0,281 0,271 0,268 0,272 0,29 0,312 0,349 0,394 0,438 0,477 0,574 0,62 0,678 0,735 0,783 0,828 0,864 0,886 0,907 0,923 0,928 0,921 0,905 0,881 0,812 0,768 0,717 0,651 0,594 0,524 0,448 0,386 0,326 0,274 0,238 0,204 0,176 0,157 0,146 0,14 0,14 0,146 0,155 0,167

0,338 0,312 0,31 0,307 0,305 0,3 0,293 0,282 0,272 0,266 0,271 0,289 0,311 0,352 0,401 0,45 0,494 0,599 0,647 0,708 0,767 0,817 0,863 0,9 0,923 0,944 0,959 0,963 0,957 0,94 0,913 0,843 0,795 0,741 0,669 0,606 0,529 0,446 0,377 0,309 0,249 0,207 0,166 0,13 0,104 0,085 0,072 0,065 0,061 0,06 0,061

0,336 0,311 0,31 0,309 0,306 0,3 0,294 0,283 0,272 0,266 0,271 0,288 0,31 0,352 0,403 0,453 0,498 0,604 0,652 0,714 0,774 0,823 0,868 0,905 0,929 0,95 0,964 0,969 0,964 0,946 0,919 0,848 0,8 0,745 0,672 0,609 0,531 0,446 0,375 0,305 0,243 0,199 0,156 0,117 0,088 0,067 0,052 0,042 0,034 0,03 0,027

555 560 565 570 575 580 585 590 595 600 605 610 615 620 625 630 635 640 645 650 655 660 665 670 675 680 685 690 695 700 705 710 715 720 725 730 735 740 745 750 755 760 765 770 775 780 785 790 795 800

1,613 1,625 1,632 1,595 1,402 0,991 0,634 0,42 0,25 0,142 0,082 0,051 0,035 0,023 0,017 0,013 0,011 0,01 0,009 0,008 0,008 0,008 0,007 0,007 0,007 0,007 0,007 0,007 0,007 0,007 0,007 0,007 0,007 0,008 0,007 0,008 0,008 0,008 0,008 0,009 0,008 0,009 0,009 0,009 0,01 0,01 0,011 0,011 0,012 0,013

1,566 1,579 1,587 1,547 1,352 0,955 0,615 0,41 0,249 0,147 0,09 0,06 0,045 0,035 0,029 0,026 0,024 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,024 0,024 0,024 0,025 0,025 0,026 0,026 0,027 0,028 0,028 0,029 0,029 0,031 0,031 0,033 0,034 0,035 0,036 0,038 0,039 0,04 0,042 0,043 0,045 0,047 0,05 0,053 0,057

1,552 1,566 1,582 1,589 1,531 1,227 0,829 0,561 0,341 0,2 0,121 0,081 0,06 0,046 0,038 0,034 0,032 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,031 0,031 0,032 0,032 0,033 0,034 0,035 0,036 0,037 0,038 0,039 0,039 0,041 0,043 0,045 0,046 0,048 0,05 0,052 0,055 0,055 0,057 0,06 0,064 0,067 0,071 0,076 0,081

0,497 0,499 0,451 0,349 0,245 0,15 0,089 0,054 0,029 0,013 0,003 -0,001 -0,004 -0,005 -0,006 -0,007 -0,007 -0,008 -0,008 -0,008 -0,009 -0,009 -0,009 -0,009 -0,01 -0,01 -0,01 -0,011 -0,011 -0,012 -0,012 -0,013 -0,013 -0,014 -0,014 -0,015 -0,015 -0,016 -0,017 -0,018 -0,019 -0,02 -0,019 -0,021 -0,022 -0,023 -0,024 -0,026 -0,027 -0,03

0,353 0,354 0,323 0,256 0,188 0,126 0,086 0,064 0,047 0,038 0,033 0,031 0,03 0,03 0,03 0,031 0,031 0,032 0,033 0,034 0,035 0,036 0,037 0,038 0,039 0,04 0,041 0,042 0,043 0,045 0,046 0,048 0,049 0,05 0,053 0,055 0,058 0,06 0,063 0,065 0,068 0,072 0,072 0,076 0,08 0,085 0,085 0,095 0,101 0,108

0,178 0,178 0,163 0,132 0,1 0,071 0,052 0,042 0,035 0,031 0,03 0,029 0,029 0,029 0,03 0,031 0,031 0,032 0,033 0,034 0,035 0,036 0,037 0,038 0,039 0,04 0,041 0,042 0,043 0,045 0,046 0,047 0,049 0,049 0,052 0,055 0,057 0,059 0,062 0,064 0,067 0,071 0,071 0,075 0,079 0,083 0,088 0,093 0,099 0,106

0,063 0,062 0,058 0,049 0,04 0,032 0,027 0,024 0,022 0,022 0,022 0,023 0,023 0,024 0,024 0,025 0,026 0,027 0,027 0,028 0,029 0,03 0,031 0,031 0,032 0,033 0,034 0,035 0,036 0,037 0,038 0,04 0,041 0,041 0,044 0,045 0,047 0,049 0,051 0,053 0,056 0,059 0,059 0,063 0,066 0,069 0,073 0,077 0,082 0,087

0,026 0,025 0,024 0,023 0,022 0,022 0,021 0,021 0,021 0,022 0,023 0,024 0,025 0,025 0,026 0,027 0,028 0,028 0,029 0,03 0,031 0,032 0,032 0,033 0,034 0,035 0,036 0,037 0,038 0,039 0,04 0,041 0,043 0,043 0,046 0,047 0,05 0,052 0,054 0,056 0,059 0,062 0,063 0,066 0,069 0,073 0,077 0,082 0,087 0,093

D. Wyniki doświadczenia: 1) Dane otrzymane z wyżej wymienionych wydruków nanieśliśmy na wspólny wykres zależności absorpcji od długości fali świetlnej. Poszczególne wykresy wykazują korelację pomiędzy pH badanego roztworu, a jego zdolnościami absorpcyjnymi.

Wykres 2.1:

2) Z wykresu 3.1 mogliśmy odczytać długości fali w punktach izobestycznych. Punkt izobestyczny (izobastyczny) – charakterystyczna długość fali, dla której różne formy spektralne związku chemicznego, występujące przy różnym pH, wykazują taką samą absorpcję Nasze punkty izobestyczne wystąpiły przy falach świetlnych o długości: - 316 nm

- 367 nm - 481 nm - 618 nm 3) Na wykresie 3.1 również wyraźnie zaobserwowaliśmy, że w przypadku próbki trzeciej najprawdopodobniej popełniliśmy błąd. Wykres ten nieznacznie odbiega od spodziewanych wartości absorpcji tej próbki dla konkretnych długości fali świetlnych. Bardzo możliwe, że błąd ten wynika z niedokładności w przygotowaniu próbki, bądź też niedokładne wypłukanie przez nas kuwety. Ze względu na poprawność pozostałych wyników możemy przyjąć, iż raczej błąd ten nie jest efektem źle skalibrowanych pipet automatycznych, niedokładności pomiaru przez spektrofotometr lub nieprecyzyjnych stężeń odczynników. Otrzymany pomiar w niewielkim tylko stopniu wpłynie na wykres i wyliczone pK w poniższym podpunkcie. Prawidłowy wykres 3.1 Próbki 3 biorąc pod uwagę krzywe roztworów o innym pH, powinien wykazywać się absorpcją niższą o ok. 0.2 wartości. 4) Z wykresu 3.1 zauważyliśmy, że maksymalną absorpcję (1.632) osiągnęła próbka 1 dla długości fali świetlnej 565 nm. Narysowaliśmy więc wykres zależności absorpcji przy tej długości fali od pH w naszych próbkach. Tabela 2.3: Wartość absorpcji próbek dla fali świetlnej o długości 565 nm Numer próbki 1 2 3 4 5 6 7 8

pH 9,97 9,01 7,94 6,98 6,81 6,47 5,91 5

Wartość absorpcji 1,632 1,587 1,582 0,451 0,323 0,163 0,058 0,024

Wykres 2.2:

5) Na powyższym wykresie wyznaczyliśmy pK czerwieni fenolowej, z własności mówiącej, że pK jest równe pH, gdy połowa związku występuje w formie kwasowej, a połowa w zasadowej. Własność ta wynika z równania Hendersona - Hasselbalcha. Z niego też widać, że gdy logarytm z ilorazu stężeń akceptora i donora wynosi zero, wtedy pH = pK.

pH = pKa + log(Cakceptora/Cdonora) Wyznaczając pH metodą graficzną, korzystając z wykresu 3.2 odczytaliśmy, że połowa związku występuje w formie kwasowej, a połowa w zasadowej dla pH=7.4 z czego wynika, że dla czerwieni fenolowej pK=7.4. Ewentualne niedokładności w otrzymanych wartościach mogą wynikać ze wspomnianego w punkcie trzecim błędu. Przy prawidłowej absorpcji Próbki 3 dla długości fali 565 nm wartość pH otrzymanego z wykresu 3.2, a w konsekwencji pK czerwieni fenolowej, powinny być o ok. pół jednostki większe.

Zadanie nr. 3 - Ćwiczenie nr. 10.4.3 – Spektrofotometryczna analiza jakościowa

A. Cel doświadczenia: Doświadczenie to ma na celu zapoznanie się z przykładem spektroskopowej analizy jakościowej związków chemicznych oraz prawem addytywności absorpcji.

B. Materiały użyte w doświadczeniu: Doświadczenie wymagało pobrania szkła laboratoryjnego, chemicznych, w liczbie 4 oraz wody destylowanej.

odczynników

C. Przebieg doświadczenia: Po uprzednim przygotowaniu wszystkich potrzebnych materiałów, sporządziłyśmy 4 roztwory. Poszczególne probówki zawierały po 10 ml wody destylowanej i kolejno:    

60 µl czerni naftalenowej 12 µl rodaminy 50 µl tioniny 3 ml octanu miedzi (II)

Przed przystąpieniem do pomiarów niezbędne było wyzerowanie aparatu. W tym celu do kuwety spektrofotometrycznej nalałyśmy wody do ¾ objętości. Po wyzerowaniu ustawiłyśmy spektrofotometr aby mierzył absorpcję przy falach długości od 800 do 300 nm (w odstępach co 5 nm). Następnie napełnialiśmy kuwetę do ¾ objętości związkami pochodzącymi z kolejnych probówek i dokonywałyśmy pomiaru ich absorpcję. Wyniki tych pomiarów zostały przedstawione w postaci tabeli (Tabela 3.1) oraz wykresu (Wykres 3.1).

Tabela 3.1: Wartość absorpcji próbek przy długościach fali świetlnych od 300 do 800 nm

Długość fali 300

Wartość absorpcji próbek Czerń Rodamina Tionina naftalenowa 0,319 0,041 0,103

Wartość absorpcji próbek Octan miedzi 0,734

Długość fali 555

Czerń naftalenowa -0,025

Rodamina

Tionina

0,111

0,212

Octan miedzi (II) 1,164

305

0,195

0,035

0,077

0,737

560

-0,025

0,091

0,227

1,228

310

0,121

0,032

0,064

0,792

565

-0,023

0,063

0,242

1,302

315

0,077

0,025

0,049

0,819

570

-0,022

0,036

0,256

1,37

320

0,046

0,019

0,033

0,829

575

-0,02

0,017

0,274

1,421

325

0,026

0,015

0,024

0,816

580

-0,019

0,007

0,301

1,462

330

0,016

0,016

0,021

0,777

585

-0,017

0,001

0,33

1,49

335

0,009

0,018

0,018

0,715

590

-0,015

-0,001

0,354

1,508

340

0,003

0,017

0,016

0,637

595

-0,013

-0,002

0,375

1,526

345

-0,001

0,019

0,015

0,566

600

-0,01

-0,003

0,38

1,544

350

-0,009

0,014

0,006

0,508

605

-0,006

-0,003

0,352

1,552

355

-0,01

0,014

0,006

0,478

610

-0,003

-0,004

0,286

1,567

360

-0,011

0,01

0,006

0,457

615

0,001

-0,003

0,21

1,577

365

-0,013

0,006

0,005

0,43

620

0,006

-0,003

0,124

1,586

370

-0,014

0,004

0,004

0,413

625

0,01

-0,003

0,07

1,585

375

-0,01

0,012

0,007

0,414

630

0,015

-0,004

0,041

1,573

380

-0,014

0,003

0,002

0,413

635

0,02

-0,003

0,024

1,534

385

-0,015

0,003

0

0,44

640

0,025

-0,004

0,015

1,454

390

-0,015

0,003

0,001

0,449

645

0,03

-0,003

0,01

1,322

395

-0,015

0,006

0,001

0,46

650

0,037

-0,004

0,008

1,103

400

-0,016

0,005

0,002

0,463

655

0,043

-0,004

0,006

0,883

405

-0,017

0,004

0,002

0,451

660

0,049

-0,003

0,005

0,674

410

-0,017

0,004

0,003

0,43

665

0,056

-0,004

0,005

0,495

415

-0,017

0,004

0,003

0,417

670

0,06

-0,004

0,004

0,385

420

-0,018

0,002

0,004

0,416

675

0,066

-0,003

0,004

0,284

425

-0,018

0,003

0,005

0,419

680

0,072

-0,003

0,003

0,198

430

-0,019

0,003

0,006

0,427

685

0,078

-0,004

0,003

0,139

435

-0,02

0,003

0,007

0,438

690

0,083

-0,003

0,003

0,098

440

-0,02

0,003

0,009

0,45

695

0,087

-0,003

0,003

0,072

445

-0,021

0,004

0,01

0,458

700

0,093

-0,004

0,003

0,051

450

-0,021

0,004

0,012

0,46

705

0,097

-0,003

0,003

0,036

455

-0,02

0,008

0,015

0,448

710

0,1

-0,003

0,003

0,027

460

-0,021

0,01

0,017

0,44

715

0,103

-0,003

0,003

0,02

465

-0,021

0,014

0,02

0,433

720

0,106

-0,002

0,004

0,015

470

-0,022

0,019

0,023

0,429

725

0,108

-0,003

0,004

0,012

475

-0,022

0,023

0,026

0,428

730

0,109

-0,002

0,005

0,009

480

-0,023

0,03

0,029

0,434

735

0,11

-0,002

0,006

0,008

485

-0,023

0,038

0,032

0,447

740

0,111

-0,002

0,006

0,007

490

-0,023

0,047

0,036

0,464

745

0,109

-0,003

0,006

0,006

495

-0,025

0,058

0,039

0,485

750

0,108

-0,003

0,007

0,006

500

-0,022

0,069

0,048

0,511

755

0,105

-0,003

0,008

0,006

505

-0,021

0,077

0,055

0,529

760

0,101

-0,002

0,008

0,006

510

-0,025

0,083

0,058

0,553

765

0,104

0,004

0,01

0,007

515

-0,026

0,088

0,068

0,604

770

0,099

0

0,01

0,007

520

-0,026

0,1

0,079

0,665

775

0,094

-0,001

0,011

0,007

525

-0,027

0,109

0,091

0,733

780

0,088

0,002

0,011

0,007

530

-0,027

0,122

0,105

0,803

785

0,083

0,003

0,013

0,008

535

-0,027

0,133

0,12

0,869

790

0,075

0,001

0,013

0,008

540

-0,026

0,139

0,141

0,943

795

0,067

0,004

0,016

0,011

545

-0,026

0,14

0,164

1,014

800

0,054

0,001

0,014

0,009

550

-0,026

0,131

0,187

1,082

Wykres 3.1: Zależność wartości absorpcji próbek od długości fali świetlnej 1,6

1,4

Absorbcja światła

1,2

1

Octan miedzi

0,8

Rodamina Tionina

0,6

Czerń naftalenowa

0,4

0,2

0 300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

-0,2

Długość fali [nm]

Wykres czerni naftalenowej: Występują tu dwa maksima adsorpcji, osiągane przy długości fali 620 nm (wartość adsorpcji wynosi 1,586) oraz 320 nm (wartość adsorpcji wynosi 0,829).

Wykres rodaminy: Maksimum adsorpcji osiągane jest tutaj przy długości fali 545 nm (wartość adsorpcji wynosi 0,140).

Wykres tioniny: Maksimum adsorpcji osiągane jest tutaj przy długości fali 600 nm (wartość adsorpcji wynosi 0,380).

Wykres octanu miedzi: Maksimum adsorpcji, osiągane przy długości fali 740 nm (wartość adsorpcji wynosi 0,111). Drugiego maksimum nie można wyznaczyć, ponieważ znajduje się ono poza skalą. Jest to spowodowane zbyt dużym stężeniem roztworu, które wpływa na niski poziom pochłaniania światła.

Spektrofotometryczna analiza jakościowa próbki X: Po otrzymaniu wszystkich pomiarów przeprowadziłyśmy pomiar nieoznaczonej próbki X. Wyniki tych pomiarów zostały przedstawione w postaci tabeli (Tabela 3.2) oraz wykresu (Wykres 3.2), a następnie porównane i zestawione z dwoma krzywymi (Wykres 3.1), które obrazują co znajdowało się w nieoznaczonej próbce X (Wykres 3.3).

Tabela 3.2: Zależność absorpcji Próbki X od długości fali świetlnej Długość fali [nm]

Absorpcja próbki X

Długość fali [nm]

Absorpcja próbki X

Długość fali [nm]

Absorpcja próbki X

Długość fali [nm]

Absorpcja próbki X

300

1,198

430

0,115

555

0,205

680

0,561

305

0,922

435

0,118

560

0,197

685

0,587

310

0,762

440

0,123

565

0,191

690

0,612

315

0,621

445

0,129

570

0,187

695

0,632

320

0,511

450

0,137

575

0,185

700

0,656

325

0,436

455

0,147

580

0,185

705

0,676

330

0,399

460

0,159

585

0,186

710

0,693

335

0,375

465

0,172

590

0,189

715

0,709

340

0,362

470

0,188

595

0,195

720

0,725

345

0,361

475

0,202

600

0,204

725

0,739

350

0,359

480

0,218

605

0,217

730

0,752

355

0,362

485

0,235

610

0,23

735

0,761

360

0,361

490

0,249

615

0,244

740

0,77

365

0,353

495

0,261

620

0,263

745

0,776

370

0,338

500

0,277

625

0,283

750

0,779

375

0,32

505

0,287

630

0,303

755

0,782

380

0,286

510

0,294

635

0,326

760

0,782

385

0,249

515

0,307

640

0,349

765

0,793

390

0,222

520

0,314

645

0,373

770

0,79

395

0,19

525

0,311

650

0,403

775

0,787

400

0,162

530

0,299

655

0,43

780

0,782

405

0,143

535

0,281

660

0,458

785

0,776

410

0,129

540

0,257

665

0,487

790

0,769

415

0,12

545

0,236

670

0,508

795

0,762

420

0,116

550

0,219

675

0,533

800

0,736

425

0,114

Wykres 3.2: Zależność wartości absorpcji Próbki X od długości fali świetlnej 1,4

Adsorpcja światła

1,2 1 0,8

Próka X 0,6 0,4 0,2 0 300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

Długość fali (nm)

Wykres 3.3: Zależność wartości absorpcji Próbki X oraz jej składowych od długości fali świetlnej

1,4 1,2

Adsorbcja światła

1 0,8 Octan miedzi (II) 0,6

Rodamina Próbka X

0,4 0,2 0 300

350

400

450

500

550

600

-0,2

Długość fali (nm)

650

700

750

800

E. Wnioski: Porównując te wykresy możemy jasno określić co zawierała w/w niezidentyfikowana próbka X. Widmo absorpcji dla tej substancji przyjmuje wartości szczytowe dla długości fali 355 nm (wartość absorpcji wynosi 0,362), 520 nm (wartość absorpcji wynosi 0,314) oraz 765 nm (wartość absorpcji wynosi 0,793). Porównując wartości absorpcji w określonych długościach fali z Wykresem 3.1, możemy wyciągnąć wniosek, że próbka X zawierała znaczne ilości octanu miedzi (II) oraz niewielką ilość rodaminy.

Zadanie nr. 4 – Zadanie dodatkowe Roztwór białka o masie 18kDa i A=0,5 rozcieńczono 4x. Współczynnik ekstynkcji wynosi  =18000dm3/mol*cm. Oblicz stężenie molowe tego białka mol/ dm3 oraz mg/ml. Rozwiązanie: A= C* ε* l C=

A  *l

Przyjmujemy długość kuwety 1cm, czyli l = 1 cm więc stężenie po rozcieńczeniu:

C1 =

0,5 1 mol  18000 *1 36000 dm 3

Stężenie przed rozcieńczeniem: C2 = C1*4 C2 =

1 1 mol *4 = 36000 9000 dm 3

1 Da = 1 g/mol

18kDa = 18000 g/mol

18000 g

-

X

-

g

ms = X =

1

M = 18000g/mol

mol

1 mola 9000

1 *18000 = 2g 9000

2 g/dm3 = 2

mg ml

Odp: Stężenie molowe tego związku wynosi odpowiednio oraz 2

V = 1 dm3

mg ml

1 mol 9000 dm 3