test LAL

Test

Limulus

ENDOSAFE®

Amebocyte

Lysate

ENDOCHROME -KM

(LAL), (USA),

jest specyficzn ą i czułą metod ą wykrywania i oznaczania st ężenia endotoksyn bakteryjnych w ró żnych materia łach: - leki, r r

- żywność, - kosmetyki, - czynniki ś rodowiskowe (zanieczyszczenia powietrza i wody) oraz - na narzędziach chirurgicznych.

Informacje ogólne: Zauważono, że endotoksyna bakteryjna (pirogen) pochodz ąca od bakterii G- wywo łuje wewnątrznaczyniową koagulacj ę u amerykańskiego kraba (skrzypłocza) - Limulu.s polyphemus. Czynnik odpowiedzialny za krzepni ęcie, w odpowiednich warunkach do świadczalnych, może wywołać - na drodze enzymatycznej - reakcj ę barwną (przy zastosowaniu składnika chromogennego) lub zm ętnienie i żelowanie roztworu (próby). Test Limulus Amebocyte Lysate (LAL), ENDOSAFE© ENDOCFIROME-K (USA), jest specyficzną i czułą metodą wykrywania i oznaczania stężenia endotoksyn bakteryjnych w różnych materiałach: leki, czynniki środowiskowe (pyły), kosmetyki czy narz ędzia chirurgiczne. Obecnie nie ma jednej, uniwersalnej i powszechnie akceptowanej procedury oznaczania endotoksyn. W związku z powyższym, niezwykle istotna jest walidacja metody poprzez zastosowanie mi ędzynarodowego standardu LAL. Zaleca si ę także przeprowadzenie międzylaboratoryjnej kontroli (z udzia łem europejskich o środków uprawnionych do kontroli międzylaboratoryjnej). W tym celu konieczna jest równie ż standaryzacja sposobu pobierania próbki, ekstrakcji, oznaczania oraz warunków przechowywania prób.

Zasada metody: Posługuj ąc się testem LAL oznaczenie st ężenia endotoksyny można przeprowadzi ć wykorzystuj ąc dwie różne metody detekcji: 1) oznaczenie turbidymetryczne 2) oznaczenie chromogenne (barwne): aI endpoint (punktu ko ńcowego) b/ metodą kinetyczną.

1*! Oznaczenie turbidymetryczne jest oparte na zdolno ści endotoksyny do wywołania żelowania próby lub standardu LAL. W metodzie tej aktywacja enzymu obecnego w lizacie

limfy z kraba Limulus polyphemus

(LAL) przez endotoksyn ę bakteryjn ą powoduje

żelowanie (krzepni ęcie) limfy. 2*/ W oznaczeniu chromogennym-kolorymetrycznym koagulogen obecny w LAL połączony jest z bezbarwnym syntetycznym substratem chromoforem p-nitroaiiilin ą i może być aktywowany przez koagulaz ę. Endotoksyna bakterii G- katalizuje aktywacj ą proenzymu obecnego w LAL. Aktywny enzym koagulaza katalizuje od łączenie p-nitroaniliny (pNA) od substratu, Uwolniona pNA, wywo łuje żółte zabarwienie roztworu, którego intensywno ść mierzy się spektrofotometrycznie przy d ługości fali = 405 mn. Szybkość aktywacji tego procesu jest zale żna od stężenia endotoksyny. Czas pojawienia si ę koloru jest odwrotnie proporcjonalny do ilo ści endotoksyny w próbie. Kinetyczne oznaczanie LAL jest bardzo czu łe i posiada szeroki zakres pomiarowy (od 0,01 (EU)/ml do 50 (EU)/ml).

A*/ odczyt przy pomocy kolorymetru z systemem optycznego pomiaru g ęstości (jako tube reader) B*/ z zastosowaniem czytnika mikrop łytkowego, który posiada: A) system ci ągłego optycznego pomiaru g ęstości lub pomiaru absorbancji, B) mikroprocesor i oprogramowanie zdolne do przeprowadzenia analizy danych z zastosowaniem regresji liniowej i wielomianowej.

Wykonanie oznaczenia: Glówne odczynniki:

Odczynnik LAL: zliofilizowany odczynnik ENDOSAFE® ENDOCHROME-KTm LAL zawiera syntetyczny substrat chromogenny oraz zbuforowany lizat amebocytów skrzyp łocza stabilizowany przez jedno i dwuwarto ściowe kationy, Standard kontrolny endotoksyny (CSE) - standard, który jest zbli żony do RSE (referencyjnego standardu endotoksyny), Referencyjny standard endotoksyny (RSE- oczyszczony LPS z Esclierichia coli, który służy jako międzynarodowy standard referencyjny, Roztwór wolny od endotoksyny - woda lub roztwór o zawarto ści <0,2 EU/ml.

Warunki oó1ne:

W przebiegu całej analizy wymagane jest zachowanie warunków aseptycznych i stosowanie wyłącznie materiałów pozbawionych endotoksyny bakteryjnej. Reakcja odczynnika LAL z

r

endotoksyną zależy od pH środowiska, pH mieszaniny w próbie powinno mie ścić się w przedziale od 6,5 do 8,0. Próby należy przechowywać zamrożone w temp. -20°C lub ni ższej. Nie należy prób (ekstraktów) wielokrotnie zamra żać i rozmrażać, gdyż wplywa to na pomiar stężenia endotoksyny w roztworze.

"-i in

5h (S7fl

Przenie ść 0,1 ml każdej próby na dno dołka (np. w płytce 96 dołkowej) wg ustalonego wcześniej protokołu (tabeli). Jednocze śnie przeprowadzi ć na płytce kalibracj ę z dwoma próbami ślepymi i w ośmiu punktach (5-8 pkt.) w zakresie od 0,05 EU/ml do 50 EU/ml. Dodatkowo w oznaczeniach nale ży umieścić próbki kontrolne z dodatkiem wzorca lub bez wzorca, jako pozytywn ą i negatywn ą kontrol ę.

Ustawi ć temperatur ę w czytniku mikropłytkowym na 37°C ± 1°C.. Pipet ą wielokanałową szybko dodać 0,1 ml LAL, rozpoczynaj ąc od blanku i negatywnej kontroli a ko ńcząc na próbie z najwi ększym stężeniem endotoksyny. Nastawi ć automatyczne mieszanie w czytniku. Wykonać pomiar: turbidymetryczny lub kinetyczny i uruchomi ć program do analizy wyników. Odczyt kinetyczny, optymalny, w komputerze nale ży prowadzi ć tak aby największa szybko ść reakcji V m mogła być użyta do określenia stężenia endotoksyny. W odczycie kinetycznym mo żna użyć do okre ślenia stężenia endotoksyny czasu jaki jest potrzebny do uzyskania absorbancji OD=0,2. Pomiar nale ży przeprowadzać przynajmniej w dwóch powtórzeniach, zalecane s ą 3.

Obliczanie wyników: Stężenie w próbkach nale ży obliczyć przez porównanie warto ści V,,,a próbki z krzywą .,

wzorcową. Próby ślepe nie powinny przekracza ć poziomu najni ższego wzorca kalibracji (0,1 EU/ml - 0,05 EU/ml). Stężenie endotoksyny w próbach nale ży odnosić do wzorców RSE lub CSE.

Protokó ł końcowy z analizy:

W dokumentacji nale ży podać m.in. następuj ące informacje: nazwisko osoby wykonuj ącej analizę, sposób ekstrakcji, datę, kod próbki, rozcieńczenie prób, wybraną metodę oceny, ilość powtórzeń, sposób wyliczenia danych, wyniki. W przypadku analizy materiahi pobranego ze środowiska należy dodatkowo sporządzić dokumentacj ę pobierania próbek, m.in.: data pobierania, miejsce poboru prób, rodzaj pobieranej próby, typ pompki i rodzaj futra, czas rozpoczęcia i zakończenia pobierania próbki, obj ętość pobranego powietrza, warunki transportu próbek, temperatura i wilgotno ść powietrza.