-w. 2. - Uzupe-nienie

2014-12-18

BARWIENIE GRAMA – ETAP I

BARWIENIE GRAMA

Fiolet krystaliczny jest zasadowym, słabo rozpuszczalnym barwnikiem, który w roztworze tworzy kationy. Łatwo penetruje przez ścianę komórkową i błonę cytoplazmatyczną bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich wnikając do wnętrza komórki. Na tym etapie wszystkie komórki wybarwione są na fioletowo.

BARWIENIE GRAMA – ETAP II

Płyn Lugola, stanowi roztwór jodu w jodku potasu. Jony jodu łatwo przenikają do wnętrza komórki, podobnie jak cząsteczki fioletu krystalicznego. Kationy barwnika reagują z jonami jodu tworząc wielkocząsteczkowe, nierozpuszczalne w wodzie kompleksy. Wszystkie komórki nadal zabarwione są na kolor fioletowy.

BARWIENIE GRAMA – ETAP III 

Trzeci etap polega na naniesieniu odbarwiacza (roztworu alkoholu lub mieszaniny acetonu z alkoholem).



Odbarwiacz wnika w warstwy mureiny bakterii powodując dehydratację. W wyniku usunięcia wody następuje zagęszczenie sieci mureiny, a tym samym zmniejszenie pustych przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych.



W wyniku działania odbarwiacza u bakterii Gram-ujemnych zniszczeniu ulega zewnętrzna błona lipopolisacharydowa eksponując cienką warstwę mureiny, w związku z czym barwnik jest łatwo wymywany odbarwiaczem



Kompleks barwnika z jodem zostaje uwięziony pod zwartą i grubą warstwą mureiny w komórkach bakterii Gram-dodatnich. 



Bakterie Gram(+) zawierają kwasy tejchojowe (polimery fosforanu glicerynowego i rybitolowego) oraz rybonukleinian magnezu połączony z białkiem. Fiolet krystaliczny po połączeniu z rybonukleinianem magnezu i jodem z płynu Lugola tworzy nierozpuszczalny w alkoholu związek – p-jodorozanilinę.

Na tym etapie następuje właściwe zróżnicowanie komórek. Komórki Gramdodatnie z uwięzionym kompleksem barwnika nadal mają zabarwienie fioletowe, podczas gdy komórki Gram-ujemne stają się bezbarwne po wypłukaniu kompleksu.

BARWIENIE GRAMA – ETAP IV

Ostatnim etapem jest dodatek barwnika kontrastowego – safraniny. Barwnik ten, podobnie jak fiolet krystaliczny, wykazuje charakter zasadowy, słabo rozpuszcza się w wodzie, a w roztworze tworzy kationy, które łatwo penetrują poprzez warstwę mureiny i łączą się z ujemnie naładowanymi cząsteczkami takimi jak kwasy tejchojowe, peptydy czy główki fosfolipidów. Ponieważ kolor safraniny jest mniej intensywny niż fioletu krystalicznego komórki Gram-dodatnie pozostają fioletowe. Bezbarwne komórki Gram-ujemne zabarwione safraniną przyjmują kolor różowy.

1

2014-12-18

Metoda barwienia

Metoda barwienia

Rodzaj

Uwidocznienie bakterii

Met. z tuszem chińskim

Prosta negatywna

Otoczki (jasne otoczki, ciemne tło)

Met. Burri – Ginsa

Złożona pozytywnonegatywna

Otoczki (jasne otoczki, czerwone komórki, ciemne tło)

Met. Dornera

Złożona pozytywnonegatywna

Przetrwalniki (czerwone, ciemne tło)

Met. Wirtza-Conklina

Złożona pozytywna

Przetrwalniki (zielone, a komórki czerwone)

Złożona pozytywna

Ziarna metachromatyczne – ciałka Ernst’a – Babesa (granatowe) u Corynebacterium spp. (żółto-zielone)

Met. Waysona

Złożona pozytywna

Preparat bezpośredni (bakterie ciemnogranatowe, inne elementy morfotyczne jasno fioletowo-granatowe)

Met. Ziehl – Neelsena

Złożona pozytywna

Bakterie kwasooporne (czerwone, a tło niebieskie)

Met. Kinyoun – Gabett’a

Złożona pozytywna

Bakterie kwasooporne (czerwone, a tło niebieskie)

Met. Kinyoun

Złożone pozytywna

Bakterie kwasooporne (czerwone, a tło zielone)

KOLONIA BAKTERYJNA

Złożona pozytywna

Podział bakterii na: Gram dodatnie Gram ujemne

MORFOLOGIA KOLONII - METODY HODOWLI I IDENTYFIKACJI

Zastosowanie

Met. Neissera

Zastosowanie

Prosta pozytywna

Metoda Grama

* - bakterie gram-zmienne

Rodzaj

Met. z błękitem metylenowym (Löfflera) / fuksyną / fioletem krystalicznym

WZROST JAKO CECHA DIAGNOSTYCZNA

Kolonią nazywamy widoczny „gołym” okiem zbiór komórek drobnoustroju wyrastających na podłożu stałym na płytce Petriego i powstały w wyniku podziałów amitotycznych pojedynczej komórki.

Bulion płynny • • • • • • •

Występowanie błonki Charakter błonki Zmętnienie lub osad Charakter zmętnienia Stopień zmętnienia Charakter osadu Zapach

Płytka Petriego • • • • • • •

Skośny agar • • • •

Intensywność wzrostu • Charakter brzegu linii• wzrostu • Konsystencja • Barwa

Wymiary kolonii Kształt kolonii Brzeg kolonii Powierzchnia kolonii Konsystencja Barwa kolonii lub podłoża Wyniosłość - profil Słupek żelatynowy Powierzchniowy Wzdłuż linii kłucia W dolnej części słupka Upłynnienie żelatyny

2

2014-12-18

MORFOLOGIA KOLONII NA PODŁOŻACH STAŁYCH Przy opisie kolonii najważniejsze są następujące cechy: • Wielkość kolonii – duże (ø > 5 mm), średnie (ø – 2-4 mm), małe (ø – 0,5-1 mm), drobne (ø < 0,5 mm),



Brzeg kolonii:



Powierzchnia kolonii: gładka, szorstka, nitkowata, ziarnista, matowa, błyszcząca;



Wyniosłość kolonii ponad powierzchnię podłoża:

pomarszczona,

• Kształt kolonii:

MORFOLOGIA KOLONII NA PODŁOŻACH STAŁYCH 

Kolor kolonii: barwa samej kolonii np. biała, kremowa, beżowa, żółta; zabarwienie podłoża wokół kolonii, strefa przejaśnienia wokół kolonii itp.



Przejrzystość kolonii: przejrzysta, mętna, opalizująca, nieprzejrzysta;



Konsystencję kolonii sprawdza się za pomocą ezy i określa jako: suchą, lepką, śluzowatą;



Zapach kolonii – jaśminu (Pseudomonas aeruginosa), odchodów końskich (Clostridium difficile) kwaśny, piwa, miodu, kasztanów, gnilny;



Zawieszalność kolonii w płynie fizjologicznym - zdolność tworzenia jednolitej zawiesiny w roztworze płynu fizjologicznego (0,85% NaCl) - łatwa lub nie, zawiesina grudkowata, niejednorodna.

WZROST NA SKOSIE AGAROWYM Przy posiewie na skosie bakterie najczęściej nie tworzą wyodrębnionych kolonii, jednak sposób wzrostu jest również ważną cechą diagnostyczną. Wzrost bakterii na skosie opisujemy uwzględniając następujące cechy: 

charakter wzrostu: drzewiasty, mgławicowy, pierzasty, korzonkowy, perlisty, jednolity, itp.;



powierzchnia rysy: lśniąca, matowa, czasem cienka, sucha błonka;



struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana;



barwa i przeźroczystość.

UPŁYNNIENIE POŻYWKI

WZROST NA SŁUPKU AGAROWYM Pozwala określić: • ruchliwość • zależność bakterii od zapotrzebowania na tlen; określenie stosunku bakterii do wolnego tlenu polega na badaniu wzrostu na słupku agarowym zaszczepionym igłą do dna probówki; bezwzględne tlenowce rosną tylko na powierzchni pożywki; bezwzględne beztlenowce rosną w dolnych partiach pożywki; względne beztlenowce rosną na całej wysokości słupka; mikroaerofile rosną tuż pod powierzchnią pożywki • upłynnianie pożywki

1. 2. 3. 4.

Jednolity Paciorkowaty Kosmkowaty Drzewiasty

1.

brak upłynnienia

2.

upłynnienie kraterowate

3.

upłynnienie

4.

upłynnienie lejkowate

5.

upłynnienie walcowate

6.

upłynnienie kielichowate

workowate

3

2014-12-18

POSIEW REDUKCYJNY

POSIEW REDUKCYJNY

Posiew redukcyjny – laboratoryjna metoda hodowania bakterii stosowana w mikrobiologii. Służy m.in. do izolacji czystych kultur bakteryjnych. 1.

Metoda polega na zanurzeniu ezy w probówce z drobnoustrojami i naniesieniu pobranego materiału na podłoże agarowe umieszczone zwykle na szalce Petriego.

2.

Posiew należy zacząć wykonywać od górnego brzegu szalki i dynamicznym ruchem zygzakowatym nanosić drobnoustroje kierując się do środka szalki, pozostawiając jednak znaczną część powierzchni wolną. Po wykonaniu tego zabiegu ezę wyżarza się w płomieniu palnika.

3.

Po obróceniu szalki o 45° w lewo ponownie wykonuje się szereg zygzakowatych ruchów, zahaczając przynajmniej raz o wcześniejszą ścieżkę.

4.

Łącznie, każdorazowo wyżarzając ezę, procedurę powtarza się 3-5 razy.

Po inkubacji, w miejscach z ostatnich etapów posiewu redukcyjnego powstaną osobne kolonie bakterii wywodzące się z pojedynczych komórek.

CECHY PODŁÓŻ MIKROBIOLOGICZNYCH

PODŁOŻA MIKROBIOLOGICZNE Podłoża mikrobiologiczne, zwane też pożywkami, są płynnymi lub zestalonymi mieszaninami z odpowiednio dobranych składników, umożliwiający mi hodowlę drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych.

Podłoża do hodowli drobnoustrojów charakteryzować się następującymi cechami:

Stosowanie podłóż pozwala na:



odpowiednią wartością odżywczą,



optymalnym odczynem pH,



izotonicznością,



stwierdzenie materiale

obecności

drobnoustrojów

w

badanym



izolację drobnoustrojów



przejrzystością (w miarę możliwości),



namnożenie wyizolowanych drobnoustrojów



sterylnością.



różnicowanie



identyfikację



określenie właściwości fizjologicznych i biochemicznych

WARTOŚĆ ODŻYWCZA

Odpowiednią wartość odżywczą podłoża uzyskuje się poprzez dobór składników niezbędnych do życia, wzrostu oraz rozmnażania się drobnoustrojów. Podłoże do hodowli heterotrofów musi zawierać substancje organiczne, które stosuje się w postaci peptonu jako źródło azotu. Pod względem zapotrzebowania na związki organiczne mikroorganizmy dzieli się na dwie grupy:  prototrofy - wymagające do wzrostu tylko jednego rodzaju związku węgla, 

auksotrofy - wymagające przynajmniej dwóch rodzajów związków węgla.

powinny

ODCZYN PODŁOŻA

Większość bakterii preferuje odczyn obojętny lub lekko zasadowy (pH ok. 7,0 – 7,5), grzyby natomiast lepiej rosną w środowisku kwaśnym (pH ok. 5,2 – 5,6). W trakcie hodowli, jej odczyn dość szybko się zmienia, z powodu powstawania produktów przemiany materii. Aby utrzymać optymalny odczyn, pożywki przygotowuje się na bazie odpowiednich buforów

4

2014-12-18

CIŚNIENIE OSMOTYCZNE Izotoniczność podłóż polega na stworzeniu w nich ciśnienia osmotycznego podobnego do panującego w komórkach – wzorcem roztworu izotonicznego jest 0,85% wodny roztwór NaCl. Rodzaje podłóż ze względu na ciśnienie osmotyczne: 

podłoże izotoniczne



podłoże hipotoniczne (o niższym ciśnieniu osmotycznym niż w komórkach) powoduje pęcznienie komórek, a nawet ich pękanie, w wyniku napływu wody do komórek



podłoże hipertoniczne (o wyższym ciśnieniu osmotycznym od panującego w komórkach) powoduje kurczenie się plazmy komórkowej i oddzielenie jej od ściany komórkowej (deplazmoliza), na skutek odpływu wody z komórki.

Przejrzystość podłóż, zwłaszcza płynnych, jest konieczna do wizualnego stwierdzenia wzrostu drobnoustrojów, który ocenia się na podstawie zmętnienia, kłaczków lub osadu. Zmętnienie pożywki przed posiewem uniemożliwia lub utrudnia stwierdzenie wzrostu drobnoustrojów lub jego charakteru.

WEDŁUG POCHODZENIA KOMPONENTÓW PODŁOŻA DZIELI SIĘ NA:

STERYLNOŚĆ Podłoża sterylizuje się w zależności autoklawach lub przez filtrację.

KLAROWNOŚĆ

od

ich

składu w



naturalne - mleko, krew, surowica krwi, soki z warzyw lub owoców; podłoża naturalne charakteryzują się zmiennym składem chemicznym,



syntetyczne - charakteryzują się ściśle określonym ilościowym i jakościowym składem chemicznych np. podłoża mineralne,



półsyntetyczne - zawierają w swym składzie składniki naturalne i określone związki chemiczne, np. bulion mięsny (ekstrakt mięsny + 1% peptonu + 0,5 NaCl).

WEDŁUG KONSYSTENCJI PODŁOŻA DZIELI SIĘ NA: 

pożywki płynne stosowane są zwykle do namnażania w celu otrzymania dużej biomasy komórek i pozyskiwania produktów ich metabolizmu, np. bulion odżywczy



pożywki półpłynne mają konsystencję pośrednią między pożywkami płynnymi a stałymi, i zawierają 0,5-1,0 % czynnika zestalającego. Służą one do badania zdolności ruchu u bakterii.



pożywki stałe stosuje się głównie do izolacji czystych szczepów, przechowywania ich, do badań morfologii kolonii, oraz w badaniach ilościowych (określaniu liczby komórek w próbie). Zawierają 1,5-3,0% czynnika zestalającego.

5

2014-12-18

METODY BIOCHEMICZNE GATUNEK

WYKORZYSTANIE METOD BIOCHEMICZNYCH DO IDENTYFIKACJI DROBNOUSTROJÓW

 Test

MIR – służy do wykrywania obecności ureazy i zdolności do syntezy indolu; przeznaczony głównie dla pałeczek  obecność ureazy – brunatne zabarwienie podłoża zawierającego mocznik  synteza indolu z tryptofanu – czerwony pierścień w powierzchniowej części pożywki

METODY BIOCHEMICZNE gazu

lub

bez,

jak

również

SYNTEZA INDOLU

Proteus vulgaris

+

+

Proteus mirabilis

+

-

Escherichia coli

-

+

METODY BIOCHEMICZNE

Podłoże Kliglera – umożliwia obserwację zdolności fermentowania laktozy i glukozy z wytworzeniem siarkowodoru.

OBECNOŚĆ UREAZY

wytwarzanie

Wykorzystywanie cytrynianu sodu jako jedynego źródła węgla

Procedura: 1. Używając hodowli drobnoustrojów hodowanych 18 – 24 h na podłożu Trypticase Soy Agar, zaszczepić probówki igłą do posiewów poprzez przebicie słupka oraz wykonanie pasmowego posiewu tam i z powrotem wzdłuż powierzchni skosu. 2. Inkubować probówki z poluzowanymi nakrętkami w temperaturze 35 ± 2°C w atmosferze tlenowej. 3. Zbadać probówki po upływie 18–24 h pod względem wzrostu i wyników reakcji.

Podłoże jałowe ma zabarwienie czerwone. Zmiany barwne:

•

pożywka Simmonsa z cytrynianem sodowym, siarczanem amonowym i błękitem bromotymolowym (wskaźnik pH)

•

Rozkład cytrynianu sodu i alkalizacja środowiska

a) żółty skos i żółty słupek podłoża - to fermentacja obu cukrów b) niezmieniona barwa podłoża - to brak fermentacji c) czerwony skos a żółty słupek - fermentacja jedynie glukozy d) wytwarzanie siarkowodoru - zaczernienie podłoża e) wytwarzanie gazu - powstawanie baniek gazu wewnątrz agaru, niekiedy rozerwanie podłoża

METODY BIOCHEMICZNE

METODY BIOCHEMICZNE 

Wykrywanie

katalazy

(katalaza - enzym z grupy oksydoreduktaz katalizujący proces rozkładu nadtlenku wodoru do wody i tlenu)  wykonanie: na szkiełku podstawowym z kroplą soli fizjologicznej rozprowadzamy badaną kolonię bakteryjną, dodajemy H2O2 i obserwujemy efekt pienienia bądź jego brak)  bakterie katalazo(+) – pienienie (Staphylococcus spp.)  bakterie katalazo(-) – brak pienienia (Streptococcus spp.)

Wykrywanie oksydazy (oksydaza – enzym, który katalizuje przenoszenie wodoru na tlen) •

wykrywanie: na badaną kolonię nakrapiamy odczynnika Kovácsa, czyli roztwór dichlorowodorku tetrametylo-pfenylenodiaminy w 1% wodnym roztworze kwasu askorbowego i obserwujemy efekt zabarwienia kolonii na kolor niebieskogranatowy w ciągu 10 sekund bądź brak takiego zabarwienia)

•

bakterie oksydazo(+) – zabarwienie kolonii (Pseudomonas aeruginosa, Moraxella spp., Neisseria spp.)

•

Bakterie oksydazo(-) – brak zabarwienia kolonii (Enterobacteriacae)

6

2014-12-18

METODY BIOCHEMICZNE Test na koagulazę (koagulaza – enzym przekształcający fibrynogen w fibrynę; może chronić bakterie przed fagocytozą poprzez opłaszczenie neutrofilów fibryną) Koagulaza związana – Clumping factor Na szkiełku podstawowym umieścić dwie krople soli fizjologicznej Sporządzić gęstą zawiesinę bakteryjną w obu kroplach  Do jednej kropli zawiesiny dodać osocza króliczego i delikatnie wymieszać  Odczyt:  w ciągu kilkunastu sekund powinny pojawiać się wyraźne kłaczki (wynik pozytywny – obecność CF).  zawiesina bakterii bez dodatku osocza powinna pozostać homogenna  

METODY BIOCHEMICZNE Oznaczanie koagulazy wolnej metoda probówkowa:  do oznaczeń stosuje się osocze królicze nierozcieńczone lub rozcieńczone pięciokrotnie jałowym, fizjologicznym roztworem chlorku sodowego  do 0,5 ml osocza dodać za pomocą ezy szczep z hodowli z podłoża agarowego  inkubować w temp. 37ºC  wynik testu odczytać po 1, 3, 6, 24 godzinach.  Odczyt:

szczepy koagulazo-dodatnie powodują powstanie w probówce wyraźnego skrzepu, szczepy koagulazo-ujemne nie powodują krzepnięcia osocza Wynik testu obserwować we wskazanym powyżej czasie (po dłuższej inkubacji, może nastąpić rozpuszczenie skrzepu przy udziale wytwarzanego przez gronkowca aktywatora plazmowego).  

S. aureus należy do gronkowców koagulazo-dodatnich, a S. epidermidis, S. saprophyticus do gronkowców koagulazo-ujemnych

METODY BIOCHEMICZNE

METODY BIOCHEMICZNE 

Testy biochemiczne – szeregi biochemiczne



Składają się z miniprobówek wykonanych z tworzywa znajdujących się na pasku również wykonanym z tworzywa. W każdej miniprobówce znajduje się odwodniony substrat i wskaźnik umożliwiający odczytanie reakcji.



Oznaczenie polega na dodaniu zawiesiny badanych bakterii do wszystkich probówek i po inkubacji dodaniu do niektórych probówek odpowiednich odczynników. Zmiany barwy zawartości probówek umożliwiają określenie, jakie substraty są rozkładane, czy też jaki rodzaj aktywności enzymatycznej występuje.



Określenie grupy lub gatunku dokonuje się na podstawie załączonego przez producenta klucza diagnostycznego w przypadku testów API bądź automatycznego odczytu przez komputer w przypadku testów ID.

Testy biochemiczne – szeregi biochemiczne  Rodzaje szeregów biochemicznych  Test API → 20 Strep – dla paciorkowców → Coryne – dla Corynebacterium → Staph – dla gronkowców → 20 E – dla Enterobacteriacae  Test ID → GN – dla pałeczek laktozo(-) → Staph – dla ziarenkowców → E – dla Enterobacteriacae (gł. Laktozo(-)) 

SYSTEMY AUTOMATYCZNE

METODY IMMUNOLOGICZNE

Systemy automatyczne stosowane są do hodowli drobnoustrojów (np. Bactec do posiewów krwi) lub do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych drobnoustrojów

Techniki diagnostyczne oparte na reakcjach antygen (Ag) przeciwciało (Ig), stosowane w diagnostyce chorób zakaźnych do wykrywania antygenów (identyfikacja drobnoustrojów), bądź przeciwciał w surowicy, płynach ustrojowych, tkankach, np. testy aglutynacji lateksowej  zastosowanie  Slidex Strepto Kit – wykrywanie antygenów grupowych paciorkowców,  Slidex Pneumo Kit – wykrywanie antygenów otoczkowych S. pneumoniae,

VITEK 2 Compact BioMerieux Phoenix BD Diagnostic Systems BD Bactec

7

2014-12-18

METODY OPARTE NA BIOLOGII MOLEKULARNEJ Amplifikacja matrycy:  

PCR (polimerase chain reaction) – łańcuchowa reakcja polimerazy ma na celu powielenie in vitro swoistych fragmentów DNA przy udziale polimerazy DNA



fragment, który ma być powielony łączy się z dwoma różnymi syntetycznymi oligonukleotydami (primerami), z których każdy jest komplementarny w stosunku do jednego łańcucha sekwencji



każda reakcja PCR składa się z określonej liczby cykli (zwykle 25-45), przy czym każdy cykl zawiera trzy oddzielone termicznie etapy: •

Denaturacja – cząsteczka DNA ulega rozdzieleniu na dwie nici (temp. 90-95°C)

•

Przyłączanie primerów do komplementarnej sekwencji, czyli matrycy (temp. 40-60 °C)

•

Elongacja – wydłużanie, czyli synteza polega na dobudowywaniu komplementarnego łańcucha DNA przez polimerazę DNA (temp. ok.70 °C)



swoisty produkt PCR (amplikon) zostaje w krótkim czasie namnożony



wykrycie amplikonu odbywa się przy zastosowaniu elektroforezy w żelu agarozowym lub w żelu poliakrylamidowym (barwienie bromkiem etydyny)

8