5. Kaliszewski i wsp. Doping Erytropoetyn_

metody badań

Wykrywanie dopingu erytropoetyną i jej analogami Paweł Kaliszewski1, Andrzej Pokrywka1, Dorota Kwiatkowska1, Zbigniew Szyguła2, Jan Pachecka3 Zakład Badań Antydopingowych, Instytut Sportu, Warszawa Instytut Fizjologii Człowieka, Akademia Wychowania Fizycznego, Kraków 3 Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 1 2

Adres do korespondencji: Paweł Kaliszewski, Zakład Badań Antydopingowych, Instytut Sportu, ul. Trylogii 2/16, 01-982 Warszawa, e-mail: [email protected]

Wstęp Rok 2010 był rokiem jubileuszu 100-lecia badań antydopingowych na świecie. Za pioniera tych badań powszechnie uznawany jest warszawski farmaceuta Alfons Bukowski, który w 1910 roku opracował metodę wykrywania alkaloidów w ślinie koni. Metoda ta znalazła powszechne zastosowanie w badaniach antydopingowych koni wyścigowych na torach w Warszawie, Budapeszcie i Wiedniu [1]. Niestety w Polsce obchody jubileuszowe pozostały w cieniu afery dopingowej, która miała miejsce w roku 2010 podczas Zimowych Igrzysk Olimpijskich w Vancouver. Reprezentantce Polski w biegach narciarskich udowodniono stosowanie erytropoetyny jako środka dopingującego. Fakt ten spowodował, że więcej uwagi poświęcono wykorzystywaniu erytropoetyny i jej analogów do nieuczciwego wspomagania zdolności wysiłkowych organizmu sportowców, a nie A. Bukowskiemu i jego niepodważalnemu wkładowi w rozwój badań antydopingowych.

Detection of erythropoietin and its analogs in doping control · In  1990, erythropoietin was added to the list of prohibited substances by the Medical Commission of the International Olympic Committee. A positive doping case for erythropoietin connected with a Polish cross country skier during the Olympic Games in Vancouver (2010) has drawn public attention in Poland to the problem of EPO abuse by athletes and methods of its detection. The first tests that allowed for the detection of doping with erythropoietin were developed before the Olympic Games in Sydney (2000). They were based on measurements of blood parameters and application of a statistical model which could indirectly indicate the erythropoietin abuse. The first direct method for detection of recombinant erythropoietin was developed by Lasne et al. in 2000 [32]. Among others it is currently still used in doping control. It is based on electrophoretic separation of proteins, according to their isoelectric point, followed by immuno-chemiluminescent detection. The fast development of analytical methods is caused by a need for detection of many new products containing erythropoietin analogues such as epoietin alpha, beta, omega and delta, and medicines containing the new generation erythropoietin analogues recently introduced to the market. Keywords: erythropoietin, EPO, doping control, sport. © Farm Pol, 2012, 68(3): 171-???

Struktura i synteza erytropoetyny Erytropoetyna (EPO) jest hormonem glikoproteinowym składającym się ze 165 aminokwasów o masie cząsteczki około 34 KDa (rycina 1). U dorosłego człowieka wytwarzana jest głównie przez nerki, a ściślej przez podobne do fibroblastów komórki okołocewkowe typu I zlokalizowane w tkance śródmiąższowej wewnętrznej kory nerki. W warunkach fizjologicznych w nerkach syntetyzowane jest prawie 90% całkowitej ilości hormonu [2, 3]. W okresie życia płodowego EPO syntetyzowane jest także w wąTom 68 · nr 3 · 2012

trobie [3, 4]. W warunkach dużego niedotlenienia u dorosłego człowieka 10–15% hormonu może być wytwarzane w wątrobie przez hepatocyty i komórki Ito, jednakże przy braku wytwarzania nerkowego, produkcja EPO w wątrobie jest niewystarczająca do utrzymania właściwego stężenia hemoglobiny. Niewielkie ilości erytropoetyny wytwarzane są także w innych narządach – śledzionie, płucach, sercu, mózgu, śliniankach, jądrach, macicy i prawdopodobnie w szpiku kostnym [2, 4, 5]. S ­ ynteza EPO

171

ASN 24

SER 126

ASN 38

ASN 83

Glikozylacja Mostek dwusiarczkowy Aminokwas

Rycina 1. Struktura erytropoetyny

w nerce podlega kontroli tzw. czujnika tlenowego (ang. oxygen sensor), a głównym czynnikiem stymulującym biosyntezę erytropoetyny jest hipoksja tkankowa. Przy niezmienionej masie erytrocytów synteza EPO warunkowana jest zależnością pomiędzy dostępnością tlenu w nerce a zapotrzebowaniem na tlen (koncepcja dostępności tlenu – ang. „available oxygen” relationship) [6]. Erytropoetyna jest katabolizowana w wątrobie tylko częściowo i w większości wydalana jest w formie niezmienionej z moczem.

Działanie erytropoetyny Erytropoetyna w warunkach fizjologicznych reguluje proliferację, różnicowanie i przeżycie komórek układu erytroidalnego, m.in. inicjuje syntezę globiny i przyłączanie do niej hemu, przyspiesza proliferację komórek szeregu erytroidalnego (BFU-E i CFU-E) oraz dojrzewanie erytroblastów [3]. W okresie 12–24 godzin po podaniu pojedynczej dawki EPO pojawiają się we krwi obwodowej nowopowstałe erytrocyty oraz ich niedojrzałe formy – retikulocyty. Najbardziej nasilona retikulocytoza obserwowana jest zazwyczaj 1–4 dni po ostrym wzroście stężenia EPO w osoczu [4]. Jako efekt działania EPO obserwuje się zwiększenie masy erytrocytów, zwiększenie poziomu hematokrytu i stężenia hemoglobiny we krwi obwodowej, a tym samym wzrost możliwości przenoszenia tlenu do tkanek obwodowych. Podobny efekt uzyskuje się przy leczeniu chorych z niedokrwistością przy pomocy ludzkiej rekombinowanej erytropoetyny (rHuEPO). Podstawowym wskazaniem do stosowania rHuEPO była do tej pory niedokrwistość w przebiegu przewlekłej niewydolności nerek, ale z czasem wskazania do stosowania EPO uległy rozszerzeniu na chorych z innymi schorzeniami przebiegającymi

172

z niedokrwistością, np. w przebiegu chorób układowych (reumatoidalne zapalenie stawów), AIDS, u wcześniaków i noworodków z konfliktem serologicznym, w chorobach rozrostowych, w hemoglobinopatiach, w niedokrwistości poporodowej, w onkologii, u chorych z przewlekłą niewydolnością serca i innych [7, 8]. Doniesienia z różnych ośrodków sugerują, że działanie erytropoetyny wykracza znacznie poza przypisywaną jej dotychczas rolę w regulacji erytropoezy. EPO działa kardio-, neuro-, hepato– i nefroprotekcyjnie, chroniąc komórki tych tkanek przed skutkami niedotlenienia. Chroni także komórki endotelialne, komórki mięśni gładkich i kardiomiocyty przed apoptozą, działa przeciwzapalnie, a także pobudza angiogenezę [5, 9]. Przedkliniczne badania na zwierzętach wskazują na lecznicze działanie rHuEPO po udarze niedokrwiennym mózgu, po urazach mózgu i nerwów obwodowych, a także w przebiegu padaczki [10]. Terapia EPO, szczególnie długotrwała, wpływa na czynność wielu narządów wydzielania wewnętrznego. Obserwowano znamienny spadek stężenia somatotropiny, prolaktyny, folitropiny, lutropiny, ACTH, kortyzolu, noradrenaliny, adrenaliny, dopaminy, aldosteronu, glukagonu, polipeptydu trzustkowego i gastryny w osoczu krwi oraz aktywności reninowej osocza. Natomiast obserwuje się wzrost stężenia insuliny, estradiolu, testosteronu, tyroksyny i ANP u hemodializowanych pacjentów leczonych EPO, szczególnie w pierwszych miesiącach terapii [11]. Wzrost syntezy testosteronu pod wpływem EPO zanotowano także u zdrowych młodych mężczyzn [12]. Obserwuje się również modulujący wpływ terapii rHuEPO na układ immunologiczny – zarówno na odpowiedź typu humoralnego, jak i komórkowego [13]. Terapia EPO u chorych z przewlekłą niewydolnością nerek może odwrócić niekorzystny wpływ niedokrwistości na układ sercowo-naczyniowy, ale może także prowadzić do wzrostu ciśnienia tętniczego krwi poprzez wzrost oporu obwodowego, zwiększenie lepkości krwi i zmniejszenie efektów działania tlenku azotu [14].

Wpływ erytropoetyny na zdolności wysiłkowe człowieka Farmakologiczne i farmakokinetyczne efekty stosowania rHuEPO na zdolności wysiłkowe zostały dosyć dokładnie prześledzone u pacjentów leczonych EPO z powodu anemii towarzyszącej niewydolności nerek. Większość badań przeprowadzono u pacjentów hemodializowanych, którym rHuEPO podawano dożylnie, podskórnie lub dootrzewnowo, uzyskując zwiększenie maksymalnego pobierania tlenu, podwyższenie progu anaerobowego oraz zwiększenie tolerancji wysiłkowej. Podobne zmiany obserwowane były także u pacjentów z innymi Tom 68 · nr 3 · 2012

metody badań

schorzeniami przebiegającymi z niedokrwistością. Zmiany te zależały przede wszystkim od poprawy wartości hematokrytu i stężenia hemoglobiny [15]. Pierwsze udokumentowane badania wpływu rHuEPO na możliwości wysiłkowe u zdrowych ludzi wykonano w 1991 roku w pracowni Ekbloma i Berglunda [16]. Przeprowadzono je z udziałem 15 studentów wychowania fizycznego, którym przez 6 tygodni podawano rHuEPO podskórnie, 3 razy w tygodniu po 20–40 IU/kg m.c., w łącznej dawce 27 700 IU (grupa I) lub 46 800 IU (grupa II). Podawanie EPO ochotnikom spowodowało wzrost poziomu hematokrytu (Ht) i stężenia hemoglobiny (Hb) o 10% oraz maksymalnej mocy aerobowej o około 7%, a także wydłużenie o 17% czasu biegu aż do zmęczenia. Zmiany te wystąpiły po podaniu stosunkowo niskich dawek rHuEPO, a podwyższony maksymalny pobór tlenu (VO2max) utrzymywał się do 2 tygodni po zakończeniu podawania EPO. Podobny przyrost VO2max, rzędu 6,5% obserwowany był przez Parisotto i wsp. [17]. Birkeland i wsp. [18] zastosowali dużo większe dawki rHuEPO – 5000 IU podawane podskórnie 3 razy w tygodniu przez 4 tygodnie w podwójnie ślepej próbie, w której brało udział 20 bardzo dobrze wytrenowanych zawodników różnych dyscyplin wytrzymałościowych. Następnego dnia po przyjęciu ostatniej dawki EPO odnotowano wzrost Ht o 19% (z wartości 42,7% do 50,8%), VO2max o 7% oraz całkowitego czasu wykonywania wysiłku aż do wyczerpania o 9%, podczas gdy w grupie z placebo nie stwierdzono ani zmian w poziomie hematokrytu, ani VO2max.

Erytropoetyna a doping Oczekiwanym przez sportowców przyjmujących erytropoetynę efektem dopingującym jest poprawa wydolności organizmu wskutek podwyższenia stężenia hemoglobiny i w konsekwencji wzrost zaopatrzenia mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych w tlen. Działania niepożądane erytropoetyny są związane bezpośrednio ze zmianami konsystencji krwi. EPO podnosi ilość krwinek czerwonych, co może prowadzić do zagęszczenia krwi. W konsekwencji wzrasta ryzyko zakrzepicy żył głębokich, zatorowości płucnej, zakrzepicy wieńcowej lub mózgowej, które mogą doprowadzić do zawału serca lub udaru niedokrwiennego mózgu. W przypadku sportowców działania niepożądane erytropoetyny mogą być dodatkowo spotęgowane przez utratę płynów i zagęszczenie krwi związane z długotrwałym wysiłkiem fizycznym. Komisja Medyczna Międzynarodowego Komitetu Olimpijskiego umieściła erytropoetynę na liście substancji dopingujących w 1990 roku. Było to konsekwencją przypuszczeń lekarzy i hematologów, że 18 zgonów zawodowych kolarzy pochodzących z Europy w okresie zaledwie czterech poprzednich Tom 68 · nr 3 · 2012

lat było następstwem stosowania EPO jako dopingu [19]. Od 2004 roku rolę głównego koordynatora w walce z dopingiem w sporcie na całym świecie sprawuje Światowa Agencja Antydopingowa (WADA – ang. World Anti-Doping Agency). WADA wprowadza regulacje związane ze zwalczaniem dopingu oraz nadzoruje ich stosowanie. W zakres działalności WADA wchodzi również ustalenie listy substancji i metod zabronionych w sporcie („Lista zabroniona”), która jest aktualizowana w każdym roku. Obecnie WADA dzieli substancje i metody zabronione w sporcie na następujące grupy: – substancje i metody zabronione w każdym czasie (podczas zawodów i poza zawodami), – substancje i metody zabronione podczas zawodów, – substancje zabronione w wybranych sportach. Erytropoetyna i jej analogi (darbepoetyna – dEPO oraz glikol metoksypolietylenowy epoetyny beta – CERA) są umieszczone w pierwszej z wymienionych grup, w klasie S2 (hormony peptydowe, czynniki wzrostu i substancje pokrewne). Warto podkreślić, że ze względu na stwierdzenie „(...) oraz inne substancje o podobnej strukturze chemicznej lub podobnym działaniu biologicznym” umieszczoną po przykładach substancji i metod zabronionych w większości klas, „Lista zabroniona” ma charakter otwarty. Pozwala to na szybką reakcję w przypadku nieterapeutycznego zastosowania przez sportowców nowych substancji farmakologicznych, w tym tych specjalnie zaprojektowanych do celów dopingowych [20].

Substancje lecznicze stymulujące erytropoezę Obecnie na rynku farmaceutycznym dostępnych jest wiele preparatów o działaniu stymulującym erytropoezę (tabela 1). Preparaty te zawierają zarówno substancje o identycznej sekwencji aminokwasowej co endogenna erytropoetyna, lecz różniące się między sobą pod względem wzoru gliTabela 1. Przykłady leków zawierających analogi erytropoetyny Substancja czynna

Preparat

Epoetyna alfa

Abseamed Eprex

Epoetyna beta

Binocrit Biopoin Eporatio NeoRecormon Retacrit Silapo

Epoetyna delta

Dynepo

Epoetyna omega

Epomax

Darbepoetyna alfa

Aranesp Nespo

Glikol metoksypolietylenowy epoetyny beta

Mircera

173

kozylacji, jak i takie, w których na skutek zmiany sekwencji aminokwasów wprowadzono dodatkowe miejsce glikozylacji. Dostępne są również preparaty, w których pożądany efekt biologiczny uzyskano poprzez modyfikację chemiczną cząsteczki erytropoetyny.

Epoetyna alfa Epoetyna alfa była pierwszą erytropoetyną rekombinowaną. Jej produkcję rozpoczęto w 1989 roku przy użyciu linii komórkowej CHO (ang. chinese hamster ovary) pochodzących z jajnika chomika chińskiego, zmodyfikowanej genetycznie poprzez wprowadzenie ludzkiego DNA kodującego erytropoetynę [21].

Epoetyna beta Epoetyna beta jest produkowana również przy użyciu linii komórkowej CHO, jednakże wyniki analiz przy użyciu żeli z ogniskowaniem izoelektrycznym wskazują, że w porównaniu z epoetyną alfa zawiera ona większą ilość zasadowych izoform [21].

Epoetyna omega Epoetyna omega jest produkowana przy użyciu modyfikowanej linii komórek BHK (ang. baby hamster kidney) pochodzących z nerek noworodka chomika. Charakteryzuje się większą zawartością zasadowych izoform niż epoetyna beta [22].

Epoetyna delta Epoetyna delta jest produkowana przy użyciu linii komórek ludzkich HT-1080 (human fibrosarcoma cells). Do komórek tych wprowadzono jedynie sekwencje promotora, który w sposób efektywny aktywuje ekspresje genu kodującego erytropoetynę [23].

(po podaniu dożylnym – 134 godz., po podaniu podskórnym – 139 godz.) w stosunku do dotychczas znanych preparatów EPO [27]. Chemicznie jest to cząsteczka erytropoetyny beta zmodyfikowana poprzez przyłączenie cząsteczki polimeru PEG (politlenku etylenu) o średniej masie cząsteczki 30 kDa.

Leki generyczne z analogami erytropoetyny Zwykle zawierają epoetynę alfa, beta lub omega. Ze względów prawnych ich produkcja jest możliwa przez każdego, ponieważ wygasły patenty na produkty oryginalne. Jednak ze względu na to, że glikozylacja produktu końcowego zależy nie tyko od linii komórkowej, jaka została użyta do produkcji, ale od przebiegu całego procesu biotechnologicznego (np. sposobu oczyszczania) preparaty te różnią się pod względem chemicznym od produktów oryginalnych [28]. Preparaty te są dużo tańsze od oryginalnych, jednakże ich stosowanie może spowodować bardzo groźne powikłanie w postaci czerwonokrwinkowej aplazji szpiku kostnego w wyniku wytworzenia przeciwciał antyerytropoetynowych. Obecnie prowadzone są badania mające na celu poszukiwanie peptydów o sekwencji innej niż erytropoetyna wykazujące zdolność pobudzania receptora erytropoetynowego i tym samym stymulowania erytropoezy. Pierwszym, opisanym już w 1996 roku związkiem, był dwunastoaminokwasowy peptyd EMP-1 [29]. Następnie w wyniku dalszych badań został opracowany preparat Hematide, który od kilku lat jest w trzeciej fazie badań klinicznych [30]. Zawiera on dimer krótkiego peptydu stymulującego erytropoezę o innej sekwencji niż EMP-1, połączony z cząsteczką polimeru PEG.

Wykrywanie dopingu erytropoetyną Model ON-OFF

Darbepoetyna alfa (NESP, novel erythropoiesis stimulating protein, nowe białko stymulujące erytropoezę) Darbepoetyna alfa jest produkowana także przy użyciu linii komórkowej CHO, ale jej sekwencja aminokwasowa została zmieniona w ten sposób, aby wprowadzić dwa dodatkowe miejsca N-glikozylacji. Darbepoetyna alfa zawiera do pięciu dodatkowych cząsteczek kwasu sialowego [24]. Dzięki temu jej okres półtrwania jest dłuższy, a aktywność biologiczna większa od epoetyn alfa i beta [25, 26].

Glikol metoksypolietylenowy epoetyny beta (CERA, continuous erythropoietin receptor activator, aktywator receptora erytropoetyny o ciągłym działaniu) Glikol metoksypolietylenowy epoetyny beta jest czynnikiem stymulującym erytropoezę trzeciej generacji o znacznie wydłużonym czasie półtrwania

174

Przez wiele lat prowadzono prace zmierzające do wprowadzenia do rutynowych analiz antydopingowych metody wykrywania dopingu erytropoetyną. Pierwszą zaakceptowaną metodą, nazwaną modelem ON-OFF, była metoda pośrednia oparta na analizie statystycznej szerokiej gamy wskaźników hematologicznych (hematokryt, retikulocyty, EPO, rozpuszczalny receptor transferyny, makrocyty). Metoda ta, opracowana przed Igrzyskami Olimpijskimi w Sydney, pozwalała na wykrycie stanu wzmożonej erytropoezy, charakterystycznej dla osób przyjmujących substancje stymulujące erytropoezę (model ON) lub stan, w którym erytropoeza jest zahamowana na skutek zaprzestania stosowania tychże substancji (model OFF) [17]. Głównym ograniczeniem modelu ON-OFF było stosowanie dla wszystkich zawodników jednolitych kryteriów, opracowanych na postawie danych zebranych tylko dla wybranych populacji. Stwarzało to możliwość Tom 68 · nr 3 · 2012

metody badań

uzyskiwania wyników fałszywie pozytywnych. Dlatego też obecnie stosowane pośrednie metody wykrywania dopingu EPO oparte są na długoterminowych badaniach indywidualnych wskaźników hematologicznych sportowców. Jest to tzw. paszport biologiczny zawodnika oparty na wyznaczeniu indywidualnych wartości progowych dla każdego sportowca [31].

Metody wykrywania erytropoetyny egzogennej Ogniskowanie izoelektryczne (IEF-PAGE) Pierwsza bezpośrednia metoda wykrywania rekombinowanej erytropoetyny została opisana przez Lasne i Ceaurriz [32]. Metodę tę można stosować do analizy próbek moczu, który wciąż jest podstawowym materiałem biologicznym, pobieranym od sportowców podczas kontroli antydopingowej. Jest ona oparta na elektroforezie z ogniskowaniem izoelektrycznym (IEF, isoelectric focusing). Pozwala na rozdział glikoform erytropoetyny różniących się między sobą masą i ładunkiem elektrycznym z powodu różnej zawartości N– i/lub O-glikanów [32, 33]. Przy jej użyciu wykazano, że erytropoetyna endogenna znacząco różni się od erytropoetyn rekombinowanych pod względem zawartości glikoform. Zastosowanie erytropoetyny rekombinowanej u zdrowego człowieka powoduje supresję wydzielania erytropoetyny endogennej i zwiększenie stężenia glikoform rekombinowanych o dużym stopniu glikozylacji. Prowadzi to do zmiany stosunku poszczególnych glikoform erytropoetyny w moczu i surowicy, co pozwala tym samym na wykrycie podania zawodnikowi erytropoetyny egzogennej. Pierwszym etapem przygotowania materiału do analizy jest zagęszczenie białek w próbkach materiału biologicznego. W tym celu wykonuje się ultrafiltrację próbki moczu przy użyciu koncentratorów wirówkowych pozwalających na zagęszczenie wszystkich białek o masie powyżej 30 kDa. W celu zapobieżenia degradacji enzymatycznej EPO, mocz należy doprowadzić do pH obojętnego lub lekko zasadowego (inaktywacja kwaśnych proteaz) oraz dodać mieszaninę inhibitorów proteaz w celu inaktywacji innych proteaz obecnych w moczu. W celu dalszej inaktywacji proteaz retentaty moczowe są następnie inkubowane w temperaturze 80°C. Aby zwiększyć rozpuszczalność EPO w wodzie, dodawany jest również detergent (zwykle TWEEN, 80 lub 20). Oznaczenie stężenia EPO w retentatach pozwala na odpowiednie dobranie objętości nakładanej na żel i w ten sposób uniknięcie przeładowania (obrazy elektroforetyczne trudne do interpretacji) lub nałożenia zbyt małej objętości (brak sygnału). Rozdział elektroforetyczny izoform EPO wykonuje się przy użyciu żelu poliakrylamidowego zawieTom 68 · nr 3 · 2012

rającego mieszaninę amfolitów, pozwalających na uzyskanie gradientu pH w zakresie od 4 do 6, z dodatkiem mocznika. W niektórych przypadkach interpretację wyników analiz może utrudniać wysokie stężenie białek w moczu, będące wynikiem np. proteinurii powysiłkowej (w przypadku próbek pobranych od sportowców tuż po zawodach). Nadmiar białek może powodować powstawanie prążków w kształcie łuków. Aby temu zapobiec, niekiedy wprowadza się dodatkowy etap oczyszczania EPO przy użyciu immobilizowanych przeciwciał anty-erytropoetyny (klon 9C21D11) lub lektyny [34]. Innym sposobem jest zastosowanie większych żeli (260x200 mm) z gradientem pH 3–5, których zaletą jest większa zdolność rozdziału glikoform EPO oraz możliwość nałożenia większych objętości próbek [35]. Specyficzne izoformy erytropoetyny uwidaczniane są przy użyciu techniki Western Blot. Białka rozdzielone w trakcie elektroforezy przenoszone są na membranę PVDF (polifluorek winylidenu). Membrana ta jest następnie inkubowana w roztworze DTT (ditiotreitol), co powoduje redukcję mostków disiarczkowych w białkach i tym samym zwiększenie czułości metody. Po zablokowaniu niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał membranę inkubuje się w roztworze zawierającym przeciwciało anty erytropoetyna – klon AE7A5 [36]. Warto dodać, że Światowa Agencja Antydopingowa w dokumencie technicznym wymusza stosowanie określonego przeciwciała w celu zapewnienia porównywalności wyników analiz uzyskanych w różnych laboratoriach antydopingowych. Następnym etapem analizy jest transfer przeciwciał anty-erytropoetyna na drugą membranę PVDF. Ma to na celu uniknięcie niespecyficznego wiązania przeciwciał drugorzędowych (anty-mouse) do białek moczowych obecnych na pierwszej membranie. W końcowych etapach druga membrana jest inkubowana w roztworze zawierającym drugorzędowe przeciwciało znakowane biotyną, oraz w roztworze zawierającym koniugat streptawidyny z peroksydazą chrzanowa (HRP). Detekcje specyficznej chemiluminescencji dokonuje się przy użyciu kamery CCD. Do analizy uzyskanych obrazów używa się specjalistycznego oprogramowania i algorytmów opublikowanych przez Bajla i wsp. [37]

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w obecności laurylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) Elektroforeza SDS-PAGE jest metodą pozwalającą na rozdzielenie białek ze względu na różnice ich mas cząsteczkowych. Niektórzy badacze wskazują na różnicę w obserwowanych masach epoetyny alfa i beta (36-38 kDa) od erytropoetyny endogennej (34 kDa) przy zastosowaniu elektroforezy SDS-PA-

175

1

2

3

4

5

6

Strefa zasadowa Strefa endogenna Strefa kwaśna Rycina 2. Identyfikacja izoform erytropoetyny przy użyciu ogniskowania izoelektrycznego (IEF-PAGE): 1– erytropoetyna endogenna, 2 – wzorce epoetyny alfa, beta oraz NESP, 3 – próbka pozytywna zawierająca epoetynę alfa i beta, 4 – próbka pozytywna zawierająca NESP, 5 – wzorzec epoetyny delta, 6 – wzorzec CERA

GE [38, 39]. Jednakże ze względu na fakt, że białka glikozylowane (np. erytropoetyna) migrują na żelach poliakrylamidowych w obecności SDS (sodium dodecyl sulfate, laurylosiarczanu sodu) w postaci szerokich prążków to prążki odpowiadające epoetynie alfa i beta oraz erytropoetynie endogennej częściowo nachodzą na siebie. Dlatego też w ocenie wyników analizy porównuje się raczej średnie masy cząsteczkowe odpowiadające przeważnie środkowi prążka. Szczególnym przypadkiem jest epoetyna delta (Denepo), która migruje na żelach w obecności SDS w postaci bardzo charakterystycznego wąskiego prążka, co dodatkowo ułatwia jej identyfikację. Ma to szczególne znaczenie, gdyż ze względu na wykorzystanie ludzkiej linii komórek do produkcji epoetyny delta, jest ona najbardziej zbliżona pod względem chemicznym do erytropoetyny endogennej, co w znacznym stopniu utrudnia jej wykrywanie przy użyciu metody IEF-PAGE [39]. W przypadku preparatów NESP (44-45 kDa) i CERA (69-78 kDa) obserwuje się dużą różnicę w migracji prążków im odpowiadających w stosunku do erytropoetyny endogennej, ze względu na znacznie większą masę cząsteczkową zawartych w nich analogów EPO. W metodzie SDS-PAGE wykorzystuje się próbki moczu przygotowywane i analizowane podobnie jak w metodzie IEF-PAGE. Jednakże ze względu na wysoką zawartość białek niezbędny jest dodatkowy etap immunooczyszczania przy użyciu immobilizowanych przeciwciał anty-erytropoetyna (klon 9C21D11). Następnie białka są rozdzielane na żelach akrylamidowych, o zawartości akrylamidu w zakresie 8–12%. [39].

176

Analiza próbek krwi Pojawienie się na rynku preparatów stymulujących erytropoezę zawierających substancje o masie około 60 kDa (CERA), które tylko w niewielkim stopniu wydalane są z moczem, wymusiło konieczność opracowania metod ich wykrywania we krwi. Jako test przesiewowy stosuje się bardzo wydajną metodę immuno-enzymatyczną (ELISA) opublikowaną w roku 2009 przez Lamon i wsp [40], w której próbkę surowicy lub osocza umieszcza się w specjalnych studzienkach z immobilizowanym przeciwciałem anty-erytropoetyna. Następnie po etapach mycia związane cząsteczki CERA są wykrywane przy pomocy znakowanych przeciwciał anty-PEG [40]. Jako metodę potwierdzeniową stosuje się zmodyfikowany IEF-PAGE, w którym zastosowano dodatkowy etap immunooczyszania próbki lub Sarcosyl-PAGE. Sarcosyl-PAGE jest metodą wykonywaną w analogiczny sposób jak SDS-PAGE, jedyną różnicą jest użycie sarkosylu (N-lauryl sarkozylu sodu) zamiast SDS (laurylosiarczanu sodu) w celu zwiększenia czułości metody [39].

Kryteria oceny wyników Aktualnie ocena wyników analiz odbywa się na podstawie kryteriów zawartych w dokumencie technicznym opublikowanym przez WADA (dokument TD2009EPO). W dokumencie tym opisane są trzy rodzaje kryteriów, które powinny być spełnione, aby wynik analizy próbki biologicznej pobranej od sportowca uznać za pozytywny (AAF, Adverse Analytical Finding, wynik niekorzystny analitycznie), czyli wskazujący na użycie EPO. Są to kryteria jakościowe i identyfikacyjne oraz kryteria stabilności próbki. Zgodnie z kryteriami jakościowymi na obrazie luminescencji membrany nie mogą znajdować się plamy i/lub powierzchnie o zwiększonym sygnale tła, które w sposób znaczący mogą wpłynąć na wynik. Ponadto obrazy luminescencji wzorców – rEPO (epoetyna alfa i beta) oraz NESP powinny pozwolić na: podział membrany na trzy strefy: zasadową, endogenną i kwaśną oraz umożliwić określenie odpowiadających sobie prążków w próbce badanej i wzorcach (rycina 2). Kryteria identyfikacji opierają się na porównaniu wyników pomiarów intensywności prążków w strefach zasadowej i kwaśnej w stosunku do strefy endogennej i dotyczą następujących analogów EPO: epoetyny alfa i beta, tzw. innych epoetyn, darbepoetyny alfa (NESP) i glikolu metoksypolietylenowego epoetyny beta (CERA). Ze względu na fakt, że w niektórych udokumentowanych przypadkach obserwowano w próbkach moczu aktywność enzymatyczną, znacząco wpływającą na wynik analiz, w trakcie procedur wykrywania dopingu erytropoetyną rekombinowaną przeprowadza się dodatkową analizę mającą na Tom 68 · nr 3 · 2012

metody badań

celu określenie stabilności próbki. Ocena stabilności próbki polega na inkubacji zagęszczonego moczu z dodatkiem odpowiednich standardów EPO (epoetyny alfa i beta oraz NESP) przez określony czas (zwykle minimum 12 godzin). Następnie przeprowadza się standardową analizę wykrywania EPO (ogniskowanie izoelektryczne). Dodatkowo, gdy kryteria identyfikacyjne nie są spełnione, a mimo to obraz luminescencji próbki badanej znacząco odbiega od obrazu wzorca endogennej erytropoetyny, przeprowadza się analizę SDS-PAGE. Dzięki zastosowaniu tej metody możliwe jest wydłużenie okna detekcji dla epoetyny delta oraz wykrycie zastosowania niektórych preparatów generycznych EPO, jak i preparatów pochodzących z tzw. czarnego rynku [39]. Ponadto, korzystając z tej metody możliwa jest analiza próbek, które nie spełniają kryteriów stabilności.

Podsumowanie Wprowadzenie do analityki antydopingowej skutecznych metod identyfikacji egzogennej erytropoetyny pozwoliło ograniczyć jej wykorzystanie jako substancji dopingującej. Mimo to laboratoria akredytowane przez WADA (aktualnie na całym świecie jest ich 35, w tym Zakład Badań Antydopingowych Instytutu Sportu w Warszawie), w których prowadzone są badania próbek biologicznych pobranych od sportowców podczas kontroli antydopingowej, wciąż odnotowują rocznie kilkadziesiąt pozytywnych przypadków dopingu EPO i jej analogami. Na szczęście ostatnio brak jest dobrze udokumentowanych doniesień opisujących przypadki zgonów sportowców w następstwie przyjmowania EPO, co niestety prawdopodobnie miało miejsce przed wprowadzeniem w 2000 roku pierwszej skutecznej metody analitycznej, pozwalającej na udowodnienie stosowania EPO jako dopingu. Doskonaleniu metod analitycznych stosowanych w zwalczaniu dopingu w sporcie sprzyjają także regulacje prawne wprowadzone przez Światową Agencję Antydopingową. Są one bardzo rygorystyczne. Pozwalają m.in. na przechowywanie próbek pobranych podczas kontroli antydopingowej do 8 lat. W przypadku konieczności przeprowadzenia badań uzupełniających próbki pobrane od sportowców mogą być w tym okresie ponownie analizowane. Dzięki temu w wielu przypadkach można zastosować nowe metody analityczne wprowadzane w ostatnim okresie do badań antydopingowych, pozwalające na identyfikowanie tych substancji, których albo nie można było wykryć wtedy, kiedy pobrano próbki, albo nie było wiadomo, że są te substancje wykorzystywane w celach dopingowych i dlatego nie były w ogóle monitorowane u zawodników. O zasadności i skuteczności takich regulacji Tom 68 · nr 3 · 2012

można było przekonać się w 2009 roku. Powtórna analiza próbek krwi pobranych od uczestników Igrzysk Olimpijskich w Pekinie w 2008 roku, którą wykonano w laboratorium w Lozannie, spowodowała zwiększenie grupy sportowców, którym udowodniono stosowanie dopingu o pięciu zawodników. Stwierdzono przyjmowanie przez nich erytropoetyny trzeciej generacji (CERA). W tej grupie byli m.in. lekkoatleta z Bahrajnu, zwycięzca biegu na 1500 metrów, oraz reprezentant Włoch, srebrny medalista w szosowym wyścigu kolarskim. Wszystkim dopingowiczom anulowano uzyskane w zawodach olimpijskich wyniki i odebrano zdobyte medale, a ich nazwiska usunięto ze statystyk olimpijskich.

Otrzymano: 2011.07.11  ·  Zaakceptowano: 2011.08.20

Piśmiennictwo 1. Pokrywka A., Gorczyca D., Jarek A., Kwiatkowska D.: In memory of Alfons Bukowski on the centenary of anti-doping research. Drug Test Anal 2010, 2: 538–541. 2. Jelkmann W.: Erythropoietin after a century of research: younger than ever. Eur J Haematol 2007, 78: 183–205. 3. Noguchi C.T.: Where the Epo cells are. Blood 2008, 111: 4836–4837. 4. Jelkmann W.: Molecular biology of erythropoietin. Intern Med 2004, 43: 649–659. 5. Maiese K., Li F., Chong Z.Z.: New avenues of exploration for erythropoietin. JAMA 2005, 293: 90–95. 6. Eckardt K.U., Kurtz A.: Regulation of ertythropoietin production. Eur J Clin Invest 2005, 35 (Suppl. 3), 13–19. 7. Marsden J.T.: Erythropoietin – measurement and clinical applications. Ann Clin Biochem 2006, 43: 97–104. 8. Van der Meer P., Groenveld H.F., Januzzi J.L. Jr, Van Veldhuisen D.J.: Erythropoietin treatment in patients with chronic heart failure: a meta-analysis. Heart 2009, 95: 1309–1314. 9. Koul D., Dhar S., Chen-Scarabelli C., Guglin M., Scarabelli T.M.: Erythropoietin: new horizon in cardiovascular medicine. Recent Pat Cardiovasc Drug Discov 2007, 2: 5–12. 10. Elfar J.C., Jacobson J.A., Puzas J.E., Rosier R.N., Zuscik M. J.: Erythropoietin accelerates functional recovery after peripheral nerve injury. J Bone Joint Surg Am 2008, 90: 1644–1653. 11. Kokot F., Więcek A., Ficek R.: Erytropoetyna a układ hormonalny. W: Rutkowski B. Erytropoetyna – od odkrycia do zastosowań klinicznych. Gdańsk: MAKmed, 2001: 187–196. 12. Foresta C., Mioni R., Bordon P., Miotto D., Montini G. Varotto A.: Erythropoietin stimulates testosterone production in man. J Clin Endocrinol Metab 1994, 78: 753–756. 13. Dębska-Ślizień A., Rutkowski B., Manitius J., Zdrojewski Z., Szołkiewicz M., Bułło B., Lizakowski S., Myśliwska J., Myśliwski A., Bryl E., Trzonkowski P., Bąkowska A., Rachoń D.: Wpływ erytropoetyny na układ immunologiczny u chorych z przewlekłą niewydolnością nerek. Pol Merkur Lekarski 2003, 15, 326–329. 14. Dudziak M., Dębska-Ślizień A., Książek A., Rutkowski B.: Erytropoetyna a układ krążenia. W: Rutkowski B. Erytropoetyna – od odkrycia do zastosowań klinicznych. Gdańsk: MAKmed, 2001: 165–176. 15. Szyguła Z.: Wpływ długotrwałego wysiłku fizycznego, zmian objętości osocza oraz diety z różną zawartością chlorku sodu na stężenie erytropoetyny w surowicy krwi mężczyzn. Kraków: AWF im. Bronisława Czecha, 2009. 16. Ekblom B., Berglund B.: Effect of erythropoietin administration on maximal aerobic power. Scand J Med Sci Sports 1991, 1: 88–93. 17. Parisotto R., Gore C.J., Emslie K.R., Ashenden M.J., Brugnara C., Howe C., Martin D.T., Trout G.J., Hahn A.G.: A novel method utilizing markers of altered erythropoiesis for the detection of recombinant human erythropoietin abuse in athletes. Haematologica 2000, 85: 564–572. 18. Birkeland, K. I., Stray-Gundersen J., Hemmersbach P., Hallen J., Haug E., Bahr R.: Effect of rhEPO administration on serum levels of sTfR and cycling performance. Med Sci Sports Exerc 2000, 32: 1238–1243. 19. Reichel C., Gmeiner G.: Erythropoietin and analogs. W: Thieme D., Hemmersbach P. Doping in Sports, Handbook of Experimental Pharmacology 195. Berlin Heidelberg: Springer Verlag, 2010: 251–294.

177

20. Pokrywka A., Kwiatkowska D., Kaliszewski P., Grucza R.: Some aspects concerning modifications of the List of Prohibited Substances and Methods in sport. Biol Sport 2010, 27: 307–314. 21. Storring P.L., Tiplady R.J., Gaines Das R.E., Stenning B.E., Lamikanra A., Rafferty B., Lee J.: Epoetin alfa and beta differ in their erythropoietin isoform compositions and biological properties. Br J Haematol 1998, 100: 79–89. 22. Pascual J.A., Belalcazar V., de Bolos C., Gutiérrez R., Llop E., Segura J.: Recombinant erythropoietin and analogues: a challenge for doping control. Ther Drug Monit 2004, 26: 175–179. 23. Deicher R., Hörl W.H.: Differentiating factors between erythropoiesis-stimulating agents: a guide to selection for anaemia of chronic kidney disease. Drugs 2004, 64, 499–509. 24. Sikora A., Oszczapowicz I.: Rekombinowane analogi erytropoetyny i pochodne w leczeniu niedokrwistości w przebiegu chorób nowotworowych. Farm Pol 2011, 67: 208–213. 25. Overbay D.K., Manley H.J.: Darbepoetin-alpha: a review of the literature. Pharmacotherapy 2002, 22: 889–897. 26. Rokicka M.: Nowe leki pobudzające erytropoezę. Współcz Onkol 2004, 8: 77–80. 27. Janda K., Sułowicz W.: Mircera – innowacyjny lek w terapii niedokrwistości chorych z przewlekłą chorobą nerek. Nephrol Dial Pol 2008, 12: 95–101. 28. Schellekens H.: Biosimilar epoetins: how similar are they? Eur J Hosp Pharm 2004, 3: 43–47. 29. Wrighton N.C., Farrell F.X., Chang R., Kashyap A.K., Barbone F.P., Mulcahy L.S., Johnson D.L., Barrett R.,W., Jolliffe L.K., Dower W.J.: Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin. Science 1996, 273: 458–463. 30. Stead R.B., Lambert J., Wessels D., Iwashita J.S., Leuther K.K., Woodburn K.W., Schatz P.J., Okamoto D.M., Naso R., Duliege A.M.: Evaluation of the safety and pharmacodynamics of Hematide, a novelerythropoietic agent, in a phase 1, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study in healthy volunteers. Blood 2006, 108: 1830–1834.

178

31. Sharpe K., Ashenden M.J., Schumacher Y.O.: A third generation approach to detect erythropoietin abuse in athletes. Haematologica 2006, 91: 356–363. 32. Lasne F., de Ceaurriz J.: Recombinant erythropoietin in urine. Nature 2000, 405, 635. 33. Lasne F.: Double-blotting: a solution to the problem of nonspecific binding of secondary antibodies in immunoblotting procedures. Methods Mol Biol. 2009, 536: 213–219. 34. Lasne F., Thioulouse J., Martin L., de Ceaurriz J.: Detection of recombinant human erythropoietin in urine for doping analysis: interpretation of isoelectric profiles by discriminant analysis. Electrophoresis 2007, 28: 1875–1881. 35. Reichel C., Holländer I., Gmeiner G.: Improvement in the background correction of Epo IEF images. W: Schänzer W., Geyer H., Gotzmann A., Mareck U. Recent advances in doping analysis (14). Köln: Sportverlag Strauß 2006: 353–362. 36. WADA Technical Document – TD2009EPO: Harmonization of the method for the identification of recombinant erythropoietins (i.e. epoetins) and analogues (e.g. darbepoetin and methoxypolyethylene glycolepoetin beta). Montreal: World Ant-Doping Agency, 2009. 37. Bajla I., Holländer I., Minichmayr M., Gmeiner G., Reichel C.: GASepo – a software solution for quantitative analysis of digital images in Epo doping control. Comput Methods Programs Biomed 2005, 80: 246–270. 38. Desharnais P., Ayotte C.: Towards the screening of urinary Epo by SDS-PAGE analysis. W: W: Schänzer W., Geyer H., Gotzmann A., Mareck U. Recent advances in doping analysis (15), Köln: Sportverlag Strauß, 2007: 303. 39. Reichel C., Kulovics R., Jordan V., Watzinger M., Geisendorfer T.: SDS-PAGE of recombinant and endogenous erythropoietins: benefits andlimitations of the method for application in doping control. Drug Test Anal 2009, 1: 43–50. 40. Lamon S., Giraud S., Egli L., Smolander J., Jarsch M., Stubenrauch K.G., Hellwig A., Saugy M., Robinson N.: A high-throughput test to detect C.E.R.A. doping in blood, J Pharm Biomed Anal 2009, 50: 954–958.

Tom 68 · nr 3 · 2012

All in-text references underlined in blue are linked to publications on ResearchGate, letting you access and read them immediately.