wspolczesna ABP mikrobiologia 2015 2016 (3)

Współczesna analiza mikrobiologiczna żywności dr inż. Anna Berthold-Pluta

Identyfikacja drobnoustrojów bakterie (Prokaryota)

Morfologia, Skład chemiczny ściany komórkowej  barwienie metodą Grama, Obecność inkluzji komórkowych oraz substancji zapasowych, Zdolność do tworzenia pigmentów, Klasyfikacja ze względu na sposób odżywiania się, Wymagania pokarmowe, Zdolność do metabolizowania węglowodanów, związków azotu, siarki, Stosunek do tlenu, Zakres temperatury, pH wzrostu, Wrażliwość na antybiotyki, Patogenność, Charakterystyka immunologiczna (typy serologiczne), Środowisko występowania, Analiza ilościowa kwasów nukleinowych (% guaniny i % cytozyny w DNA), Sekwencja polinukleotydów podjednostki rybosomu 16S rRNA.

Identyfikacja drobnoustrojów drożdże (Eukaryota)

Morfologia, Sposób rozmnażania generatywnego i wegetatywnego, Cechy hodowlane populacji na pożywkach stałych i płynnych, Zdolność do tworzenia pigmentów, Zdolność tworzenia spor, pseudogrzybni, grzybni, Zdolność do metabolizowania węglowodanów, związków azotu, siarki, Osmotolerancyjność, osmofilność (wzrost w środowisku z 50% i 60% cukru, odpowiednio), Budowa ściany komórkowej, Występowanie w środowisku, Patogenność, Analiza ilościowa kwasów nukleinowych (% guaniny i % cytozyny w DNA), Sekwencja polinukleotydów podjednostki rybosomu 18S rRNA.

Identyfikacja drobnoustrojów pleśnie (Eukaryota)

Morfologia i cechy makroskopowe grzybni, Tworzenie i wygląd konidiów, Zdolności biochemiczne, Patogenność, Analiza ilościowa kwasów nukleinowych (% guaniny i % cytozyny w DNA), Sekwencja polinukleotydów podjednostki rybosomu 18S rRNA.

Identyfikacja drobnoustrojów metody Biochemiczne, Biofizyczne, Oparte na homologii kwasów DNA i RNA, Immunologiczne.

Identyfikacja drobnoustrojów

–

metody biochemiczne

Polegają na określeniu uzdolnień mikroorganizmów do • asymilacji, • fermentacji, • rozkładu określonych zwiazków. Różne grupy drobnoustrojów charakteryzują się posiadaniem specyficznych układów enzymatycznych. Cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych, zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych.

Identyfikacja drobnoustrojów

–

metody biochemiczne

Wynik testu odczytuje się makroskopowo poprzez: • obserwację wzrostu, • zmianę zabarwienia pożywki powstałą, jako efekt metabolizmu drobnoustrojów, • wywołanie reakcji barwnej przez wprowadzenie odczynnika reagującego z metabolitem wytwarzanym przez badane mikroorganizmy, • wydzielanie gazu.

Odczyt testów prowadzi się po czasie inkubacji niezbędnym do dokonania obserwacji makroskopowych.

Identyfikacja drobnoustrojów

–

metody biochemiczne

Obecnie stosowane testy biochemiczne interpretowane są w oparciu o analizę numeryczną biorącą pod uwagę tylko wyniki pozytywne w stosunku do badanej cechy. W zależności od stosowanego systemu, pojedyncza cecha lub grupa cech ma przypisaną wartość liczbową zależną od jej ważności. Ze względu na skomplikowanie, często redukuje się liczbę testów, określa cechy najważniejsze taksonomicznie i przypisuje najwyższą wartość numeryczną. Badany szczep zostaje opisany przez kilku- lub kilkunasto-cyfrowy kod liczbowy. Nazwę gatunku identyfikowanego drobnoustroju odczytuje się z opracowanej dla danego zestawu testów książki kodowej lub korzystając z komputerowych baz danych. Metodyka tradycyjna jest wyjątkowo pracochłonna, czasochłonna i materiałochłonna

Identyfikacja drobnoustrojów metody biochemiczne –

udoskonalenia

Zestawy API umożliwiają identyfikację ponad 550 gatunków bakterii, głównie chorobotwórczych lub potencjalnie chorobotwórczych, należących do: Listeria, Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, niefermentujących pałeczek Gram(-), drożdży. Czas inkubacji zestawu zaszczepionego czystą kulturą identyfikowanych drobnoustrojów wynosi zwykle od 18 do 48 godzin.

–

Identyfikacja drobnoustrojów metody biochemiczne –

udoskonalenia

–

Identyfikacja drobnoustrojów metody biochemiczne –

udoskonalenia

Nazwa systemu

Identyfikowane drobnoustroje

Liczba gatunk6w

Czas inkubacji w godzinach

API 20E

paleczki gramujemne

108

18-24

RapiD 20E

Enterobacteriaceae paleczki gramujemne z wyjatkiem Enterobacteriaceae

61

4

64

24-48

API 50CH (CHB,CHL, CHE)

Bacillus, Lactobacillus

187

48

API 10E/10S

paleczki gramujemne (uproszczona identyfikacja)

50

18-24

API Campy

Campylobacter

18

24

API Staph

Staphylococcus, Micrococcus

22

18-24

APICoryne

Corynebacterium

33

24

API 20Strep

Streptococcus

47

4-24

API Listeria

Listeria bakterie beztlenowe gramujemne i gramdodatnie drozdze

6

24

67

24-48

43

24-48

API20NE

API20A API 20C AUX

–

Identyfikacja drobnoustrojów metody biochemiczne –

–

udoskonalenia

Wersje zautomatyzowane opisywanego systemu identyfikacji oprócz zestawu mikroprobówek zawierają densytometr do standaryzacji gęstości zawiesiny drobnoustrojów, automatyczną pipetę do dozowania zawiesiny oraz czytnik umożliwiający automatyczny odczyt i rejestrację wyniku. Do określenia gatunku można wykorzystać program komputerowy system APILAB plus. Po wprowadzeniu wyniku testu w postaci numerycznej do pamięci komputera, otrzymuje się wydruk listy możliwych gatunków wraz z % prawdopodobieństwa identyfikacji. Analizatory tego typu (tzw. mini API), pozwalają również na określenie wrażliwości identyfikowanego mikroorganizmu na 20 antybiotyków. Uzyskuje się także pełen profil biochemiczny drobnoustroju oraz dodatkowe informacje dotyczące nietypowych testów lub dalszych testów pozwalających na rozróżnienie zbliżonych gatunków.

Identyfikacja drobnoustrojów metody biochemiczne –

udoskonalenia

–

Identyfikacja drobnoustrojów metody biochemiczne –

udoskonalenia

–

Metody immunologiczne - podstawowe definicje

Przeciwciało – ciała odpornościowe, immunoglobuliny (Ig), substancje białkowe zdolne do swoistego łączenia się z antygenem, przeciwciała wytwarzane są w limfocytach B i plazmocytach; występują w dwóch postaciach: jako receptory powierzchniowe limfocytów B związane z błoną komórkową oraz jako wolne białka występujące w płynach ustrojowych; cząsteczka przeciwciała składa się z reguły z czterech łańcuchów polipeptydowych: 2 łańcuchów identycznych ciężkich połączonych ze sobą (H) i 2 kolejnych identycznych łańcuchów lekkich (L).

L H

H L

U ssaków: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM

Metody immunologiczne

–

podstawowe definicje

Antygen – substancja, którą cechuje:  Immunogenność (zdolność do wywoływania przeciw sobie swoistej odpowiedzi immunologicznej w organizmie),  Antygenowość (zdolność do swoistego łączenia się z przeciwciałami lub receptorami limfocytów T).

Metody immunologiczne

Metody immunologiczne oparte są na specyficznej reakcji zachodzącej pomiędzy przeciwciałem i antygenem. Antygenem mogą być komórki mikroorganizmów tzw. antygen cząstkowy lub ich specyficzne metabolity, np. toksyny pełniące rolę antygenu rozpuszczalnego.

Metody immunologiczne

Testy aglutynacyjne

Testy immunoenzymatyczne EIA (Enzyme Immuno Assay), w tym ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Metody immunologiczne

Testy aglutynacyjne Testy aglutynacyjne umożliwiają diagnozowanie gatunków bakterii i pleśni na podstawie analizy antygenów ścian komórkowych, komórek lub specyficznych toksyn wytwarzanych przez komórki. W celu wzmocnienia wizualnego efektu aglutynacji często stosuje się system, w którym małe cząsteczki lateksu (około 0,8 m średnicy) zostają opłaszczone przeciwciałem. Wprowadzenie specyficznego antygenu wywołuje reakcję immunologiczną pociągającą za sobą wtórną aglutynację, spowodowaną agregacją cząstek lateksu opłaszczonych przeciwciałem.

Metody immunologiczne aglutynacyjne Schemat reakcji aglutynacji

Metody immunologiczne aglutynacyjne Test do identyfikacji szczepów chorobotwórczych St. aureus

20 sek.

Cząsteczki niebieskiego lateksu opłaszczonego fibrynogenem, immunoglobuliną IgG i specyficznymi przeciwciałami dla jednego ze składników komórek St.aureus aglutynują w obecności gronkowca.

Metody immunologiczne aglutynacyjne

Metody immunologiczne

Testy immunoenzymatyczne EIA (Enzyme Immuno Assay), w tym ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) • Bezpośrednia współzawodnicza ELISA (Direct Competitive ELISA) • Pośrednia współzawodnicza ELISA (Indirect Competitive ELISA), • Kanapkowa ELISA (Double Antibody Sandwich ELISA)

Metody immunoenzymatyczne W celu obniżenia progu wykrywalności reakcji immunologicznych stosuje się techniki immunoenzymatyczne, w których przeciwciała lub antygeny połączone są z enzymami lub radioizotopami. Reakcja pomiędzy antygenem i przeciwciałem wykrywana jest przez specyficzne znakowanie samego przeciwciała fluorochromami (np. fluoresceiną, rodaminą, fikoerytryną, fikocyjaniną), radioizotopem lub enzymem (np. peroksydazą chrzanową, fosfatazą alkaliczną, czy -galaktozydazą).

Metody immunoenzymatyczne Znakowanie przeciwciała przez przyłączenie do niego enzymu umożliwia wykrycie reakcji immunologicznej po dodaniu kompleksu chromogenu z substratem enzymu. Zmiana barwy środowiska na skutek utworzenia barwnego produktu reakcji pozwala na wykrycie nawet małych ilości antygenu. Przeciwciała w większości testów unieruchomione są na stałych nośnikach w postaci: • Plastikowych probówek, • Mikropłytek, • Szklanych kuleczek, • Patyczków z tworzyw sztucznych, włókna szklanego, lateksu itp.

Metody immunoenzymatyczne Zasada działania testu ELISA przeciwciało związane z określonym enzymem może specyficznie rozpoznawać wykrywane białko (antygen), unieruchomione na podłożu. Po dodaniu przeciwciała następuje utworzenie kompleksów (przeciwciało także zostaje unieruchomione). Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała i dodaniu substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem zachodzi reakcja enzymatyczna, czemu z kolei towarzyszy pojawienie się produktu. Wykrycie obecności produktu (może to być np. produkt barwny powstający z bezbarwnego substratu) świadczy o obecności badanego białka (antygenu) w próbce. Można zmierzyć ilość powstającego produktu, a wtedy określi się ilość wykrywanego białka.

Metody immunoenzymatyczne – sandwich ELISA Umieszczenie specyficznego względem danego antygenu przeciwciała na fazie stałej tzw. nośniku, np. płytce (1, 2). Po wypłukaniu przeciwciał, które nie związały się z płytką, można dodać badany materiał (3). Jeśli w materiale znajduje się poszukiwane białko, będzie się ono łączyć do przeciwciał związanych z płytką. Po dodaniu badanego materiału płytkę znowu się przepłukuje. Na płytce powinny pozostać jedynie przeciwciała, a jeżeli badany antygen był obecny do niektórych przynajmniej przeciwciał powinien być przyłączony antygen (4).

Metody immunoenzymatyczne – Sandwich ELISA c.d. W celu stwierdzenia, czy antygen jest już wyodrębniony z mieszaniny dodaje się kolejne przeciwciało, tym razem oznakowane enzymem (5). Przeciwciało to również jest specyficzne względem poszukiwanego antygenu, jednak rozpoznaje inny region cząsteczki białka - dzięki temu przeciwciało użyte do wychwycenia antygenu nie blokuje przeciwciała znakowanego enzymem. Po przepłukaniu uzyskujemy strukturę "kanapki" (sandwich), antygen znajduje się pomiędzy dwiema warstwami przeciwciał (6). Dodaje się substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem (7 - substrat to białe koła, enzym zaś - żółte). Zwykle stosuje się związki, które w wyniku reakcji enzymatycznej przechodzą w barwny produkt (8 - fioletowe koła). Stosując spektrofotometr można określić natężenie barwy po określonym czasie trwania reakcji  metoda ilościowa.

Metody immunoenzymatyczne Metoda bezpośrednia współzawodnicza (kompetytywna) ELISA: 1. Związanie przeciwciała specyficznego dla danego antygenu z fazą stałą (np. powierzchnią mikropłytki). 2. Dodanie określonej ilości antygenu oznakowanego enzymem oraz badanej próbki. Próbka zawiera antygen, który nie jest połączony z enzymem tzn. jest nieoznakowany. Ilość miejsc wiążących przeciwciała jest ograniczona, zatem antygeny oznakowane oraz pochodzące z próbki współzawodniczą o przeciwciała. 3. Ilość oznakowanego antygenu związanego z przeciwciałem jest odwrotnie proporcjonalna do zawartości antygenu w próbce.

22 godziny

Metody Sandwich ELISA immunochromatograficzne

1. Naniesienie w postaci paska na porowatą membranę zabarwionych na niebiesko cząsteczek lateksu związanych ze specyficznymi przeciwciałami (lateks opłaszczony przeciwciałami), 2. dodanie badanej próbki wraz z antygenem, 3. powstanie kompleksu antygen + przeciwciało + cząsteczki lateksu i migracja tego kompleksu wzdłuż membrany, 4. Na około 1/3 długości membrany znajdują się unieruchomione przeciwciała właściwe dla danego antygenu, naniesione w postaci paska, 5. Migrujący kompleks zostaje unieruchomiony na skutek reakcji z przeciwciałami, co powoduje powstanie niebieskiego paska. 6. Niezwiązany nadmiar lateksu opłaszczonego przeciwciałami migruje dalej i spotyka pasek przeciwciał IgG – tworzy się kolejny barwny pasek - kontrola prawidłowości wykonania testu.

Przykłady: szybkie testy do wykrywania verotoksyn E.coli, toksyn B.cereus, obecności E.coli 0157:H7, Salmonella

Przykłady: szybkie testy do wykrywania verotoksyn E.coli, toksyn B.cereus, obecności E.coli 0157:H7, Salmonella