wspolczesna ABP mikrobiologia 2015 2016 (2)

Współczesna analiza mikrobiologiczna żywności Dr inż. Anna Berthold-Pluta

Szybkie metody określania liczby drobnoustrojów (rapid methods) To takie, w których czas analizy nie przekracza 24 godzin, ale zwykle preferowane te, w których wynik uzyskuje się po 2-3 godzinach

Szybkie metody określania liczby drobnoustrojów (rapid methods)

Ich wprowadzenie do rutynowych badań uzależnione jest od następujących czynników:  możliwość uzyskania wyniku po 30 min. do 2 godzin,  wysoka czułość,  możliwie niskie koszty,  możliwość dokonania obiektywnego odczytu za pomocą odpowiedniej aparatury,  łatwość procedury,  możliwość zautomatyzowania,  wyeliminowanie wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych.

Szybkie metody określania liczby drobnoustrojów (rapid methods)

metody biochemiczne

metody biofizyczne

Szybkie metody określania liczby drobnoustrojów (rapid methods)

metody biochemiczne Oznaczenie: • aktywności enzymów (dehydrogenazy, katalazy, -D-glukoronidazy), • poziomu określonych metabolitów (ATP, kwasu pirogronowego, endotoksyn), • wzrostu zawartości wolnych kwasów tłuszczowych  aktywność lipolityczna, • wzrostu zawartości amoniaku  aktywność proteolityczna, • wzrostu zawartości kwasów  aktywność kwasząca, • wytwarzania CO2  metabolizm węglowodanów, • poziomu specyficznych składników komórkowych (ergosterolu, chityny).

Szybkie metody określania liczby drobnoustrojów (rapid methods)

metody biofizyczne • pomiar zmętnienia pożywek w czasie wzrostu drobnoustrojów (turbidymetria), • pomiar zmian impedancji lub konduktancji środowiska pod wpływem rozwoju drobnoustrojów, • metody radiometryczne, • metody kalorymetryczne, • cytometria przepływowa.

Metody biochemiczne – pomiar zawartości pirogronianu Oznaczenie zawartości pirogronianu może służyć do określania jakości mikrobiologicznej żywności, szczególnie mleka. Pomiar jest szybki, tani i może być wykonywany automatycznie. Wykorzystano do tego celu metodę enzymatycznej redukcji kwasu pirogronowego przez dehydrogenazę mleczanową, zgodnie z reakcją:

NADH+H+

NAD+

kwas pirogronowy

kwas mlekowy dehydrogenaza mleczanowa

Metody biochemiczne – pomiar zawartości pirogronianu Obniżenie ilości zredukowanego NADH2 jest równoważne do zawartości pirogronianu w badanej próbce. Pomiaru ilości NADH2 dokonuje się przy długości fali 340 nm. Problemem jest pirogronian naturalnie występujący w żywności, np. w mleku jego ilość zależy od stanu zdrowia krów, warunków żywieniowych, okresu laktacji. Metoda szybka, ale dosyć niedokładna.

Metody biochemiczne – pomiar zawartości pirogronianu

Metody biochemiczne – pomiar zawartości pirogronianu

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP Metoda bioluminescencyjnego pomiaru ATP (adenozyno-5-trifosforanu) dostarcza bardzo szybko wyników informujących o liczbie żywych komórek w środowisku. Zakłada się, że średnia zawartość ATP w komórkach bakterii wynosi 1 fg, a w komórkach drożdży 100 fg. ATP - nukleotyd, który spełnia rolę ,,magazynu energii" i jest niezbędny dla funkcjonowania komórek, w zależności od stanu fizjologicznego, czy rodzaju bakterii, ilość ATP w komórkach może się wahać od 0,1 do 5,5 fg (1 femtogram = 10-15g).

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP

Mikroorganizmy Pseudomonas fluorescens Leuconostoc mesenteroides Escherichia coli Lactobacillus sp. Mieszanina bakterii Torulopsis sp. Saccharomyces cerevisiae Mieszanina drożdży

ATP [fg/kom.] 0.6 0.7 1.0 2.0-2.2 1.0 144.0 155.0 100.0

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP Określając zawartość ATP w populacji drobnoustrojów, można uzyskać wysoki poziom tego związku w okresie intensywnego namnażania mikroorganizmów i spadek poziomu ATP w fazie ich zamierania. Gdy komórki mikroorganizmów giną ustaje produkcja ATP, a wytworzony do tej pory ATP jest natychmiast rozkładany przez ATP-azę i inne fosfatazy. Metodę oznaczania ATP stosuje się do: • badania stanu higienicznego zakładu, linii produkcyjnych, • określenia liczby drobnoustrojów w środowisku (należy najpierw usunąć ATP wprowadzony z surowcami lub produktami za pomocą preparatów enzymatycznych, a następnie oznaczyć ATP związany z obecnością mikroorganizmów).

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP Stężenie ATP w próbkach może być mierzone w prosty sposób w reakcji z zastosowaniem substratu i enzymu, tj. lucyferyny i lucyferazy świetlika (Photinus pyralis). Reakcja bioluminescencji przebiega w sposób następujący: lucyferaza Lucyferyna + ATP Mg2+

Utleniona + AMP + CO2 + fotony światła lucyferyna

W wyniku reakcji wydzielane jest światło w ilościach proporcjonalnych do ilości ATP. Reakcja jest zależna od obecności jonów magnezu, optymalne warunki: pH 7,8-7,9, 25°C (20-30°C). Zakłada się, że ilość ATP w komórkach jest dość stała, a więc ilość emitowanego światła będzie proporcjonalna do liczby żywych komórek.

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP • Intensywność światła - bioluminescencja jest mierzona luminometrem o dużej czułości przy długości fali 562 nm, • bioluminescencja jest proporcjonalna do ilości obecnego w próbce ATP, czyli do liczby żywych komórek w analizowanej próbce, • wynik pomiaru podawany jest w jednostkach RLU (ang. Relative Light Unit - względne jednostki świetlne).

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP Etapy procedury są następujące: • ekstrakcja ATP (dla zwiększenia przepuszczalności membran komórkowych w celu uwolnienia ATP, stosuje się związki chemiczne - kwasy, rozpuszczalniki organiczne, związki powierzchniowo czynne), • dodatek enzymu lucyferazy oraz substratu lucyferyny do badanej próbki (enzym w obecności ATP katalizuje reakcję oksydatywnej dekarboksylacji lucyferyny), • pomiar emisji światła przy użyciu czułego fotometru (luminometru).

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP Wykorzystanie: • badanie mikrobiologicznego zanieczyszczenia żywności, np. napojów, mleka, śmietanki i innych produktów, powierzchni mięsa, • do kontroli procesów biotechnologicznych, • szerokie zastosowanie do kontroli higieny produkcji, • do oceny skuteczności dezynfekcji i mycia urządzeń i linii produkcyjnych (zakłady mleczarskie i piwowarskie) • szczególnie cenna przy wprowadzaniu systemu HACCP, pozwala na monitorowanie krytycznych punktów kontroli.

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP Zalety: • krótki czas badania (1 minuta), • prostota oznaczenia i interpretacji wyników, • możliwość stosowania luminometrów bezpośrednio w warunkach produkcyjnych, • badanie nie wymaga wiedzy ze strony obsługującego aparat (oznaczenia skuteczności mycia mogą wykonywać pracownicy produkcyjni, a nie laboranci), • urządzenia pomiarowe są z reguły przenośne i małych rozmiarów.

Metody biochemiczne – bioluminescencyjny pomiar ATP

Monitoring higieny –Uni-LiteXcel

Metody biochemiczne – oznaczanie innych składników komórkowych • Pomiar zawartości chityny i ergosterolu wykorzystywany do oznaczania obecności i liczby komórek grzybów, • chityna – składnik ściany komórkowej, a ergosterol – składnik błony komórkowej grzybów, związki te nie występują w komórkach roślinnych, • poziomy obu związków są wskaźnikami grzybowego zanieczyszczenia surowców i produktów roślinnych (np. przetwory pomidorowe), • metody określania poziomu obu związków – HPLC, GC, chromatografia cienkowarstwowa, spektrofotometria UV i IR, • umożliwiają skrócenie czasu analiz z kilku dni (>5 dni) metody płytkowej do kilku godzin.

Metody biofizyczne - określanie liczby drobnoustrojów metodą cytometrii przepływowej

• Polega na przepuszczaniu zawiesiny komórek przez kapilarę o średnicy trochę większej niż średnica liczonych komórek. W celu uszeregowania komórek wprowadza się cienką stróżkę zawiesiny drobnoustrojów do centralnej części kapilary, przez którą przepływa w sposób laminarny roztwór próbki. • Szybkość przepływu cieczy w kapilarze waha się od 10 do 20 m/sek, co daje możliwość liczenia od 104 do 106 komórek/minutę. • Strumień cieczy w kapilarze oświetlany jest skupioną wiązką, światła lasera argonowego o długości fali 488 nm. Po przeciwnej stronie źródła światła umieszczony jest fotopowielacz, który rejestruje intensywność wiązki przechodzącej przez przepływającą próbkę.

Metody biofizyczne - określanie liczby drobnoustrojów metodą cytometrii przepływowej • Gdy na drodze wiązki światła pojawi się komórka, to fotopowielacz wytworzy odpowiedni sygnał elektryczny, który zlicza licznik. • Drugi fotopowielacz umieszczony prostopadle do wiązki światła rejestruje promieniowanie rozproszone na przepływających cząstkach. • Sygnały otrzymane z obu fotopowielaczy pozwalają na pomiar liczby przepływających komórek, określenie kształtu komórek, ich wielkości, żywotności. • W niektórych urządzeniach wykorzystuje się związki fluorochromowe dla selektywnego znakowania określonych składników komórek np. białek, kwasów nukleinowych, czy lipidów.

Metody biofizyczne - określanie liczby drobnoustrojów metodą cytometrii przepływowej

Metody biofizyczne - określanie liczby drobnoustrojów metodą cytometrii przepływowej Zastosowanie: • kontrola prawidłowości przebiegu procesów biotechnologicznych opartych o hodowle mikroorganizmów, • określanie ogólnej liczby drobnoustrojów w próbkach płynnych produktów spożywczych (mleko surowe), • określanie liczby drożdży w procesach fermentacyjnych, • do wykrywania różnych grup drobnoustrojów chorobotwórczych, • zastosowanie równocześnie techniki immunofluorescencji pozwala np. na wykrywanie L. monocytogenes w surowym mleku.

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne Impedancja jest opornością przepływu prądu zmiennego przez przewodzącą pożywkę. Kompleksowe składniki pożywek (węglowodany, tłuszcze, białka), elektrycznie obojętne lub słabo zjonizowane są katabolizowane podczas rozwoju drobnoustrojów do zjonizowanych produktów metabolicznych, takich jak: aminokwasy, kwasy organiczne i inne niskocząsteczkowe metabolity. Rozwój mikroorganizmów prowadzi do obniżenia całkowitej impedancji podłoża, podczas gdy konduktancja (siła jonowa) i przewodnictwo - zwiększają się.

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne Miernikiem liczby drobnoustrojów jest czas, zwany czasem detekcji, IDT (ang. impedance detection time) lub DT (ang. detection time), po którym następuje mierzalna zmiana impedancji środowiska. Czas detekcji, czyli czas od rozpoczęcia pomiaru do momentu stwierdzenia zmian właściwości elektrycznych środowiska, jest tym krótszy, im liczba drobnoustrojów w środowisku jest większa, czyli większe zanieczyszczenie.

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne Z reguły mierzalna zmiana impedancji środowiska występuje, gdy liczebność bakterii osiąga poziom 106 komórek, a drożdży i grzybów strzępkowych - 104 komórek. Czas wykrycia 1 komórki bakterii z grupy coli wynosi około 9 godzin, 1 komórki drożdżowej - około 19 godzin. Stosując metodę impedymetryczną można określić ogólną liczbę drobnoustrojów, a przy zastosowaniu pożywek selektywnych także bakterie chorobotwórcze, drożdże i pleśnie.

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne Zastosowanie: • badanie jakości mikrobiologicznej mleka surowego, mięsa, produktów mlecznych, soków, jarzyn, przypraw i kosmetyków, • szybkie testowanie aktywności szczepionek do procesów fermentacyjnych, • do kontroli jałowości produktów spożywczych, farmaceutycznych, czy biotechnologicznych.

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne

Metody biofizyczne – metody impedymetryczne

Monitoring higieny -Envirocheck płytki kontaktowe

paski kontaktowe

Monitoring higieny -HYGICULT

Monitoring higieny -HYGICULT

Monitoring higieny -HYGICULT