2 A replikacjatranskrypcja

REPLIKACJA DNA ORGANIZMÓW EUKARIOTYCZNYCH

Replikacja DNA Substraty: DNA, dNTP, ATP - energia dla helikaz; Enzymy: helikazy - rozrywają wiązania wodorowe między nićmi DNA, rozkręcając helisę i umożliwiając rozpoczęcie procesu; prymaza - syntetyzuje starter RNA; polimeraza DNA - polimeryzuje dNTP zgodnie z zasadą komplementarności; egzonukleaza - usuwa startery RNA; ligaza DNA - uzupełnia brakujące wiązania fosfodiestrowe w szkielecie nowo-zsyntezowanej nici DNA różne enzymy pomocnicze - podwójna nić DNA ulega skopiowaniu. - semikonserwatywna.

Istotne różnice występują między bakteriami, a archea i eukariontami. U bakterii replikacja zaczyna się w ustalonym miejscu i postępuje bardzo szybko, z prędkością rzędu 1000 nukleotydów/s.

U eukariotów - ok. 50 nukleotydów/s, równocześnie w wielu miejscach. Polimeraza DNA działa w kierunku od końca 3' do końca 5' (czyli syntetyzuje nową nić w kierunku od 5' do 3'). Z tego powodu jedna z nici jest syntezowana w sposób ciągły, druga fragmentami (tzw. fragmenty Okazaki).

Inicjacja replikacji Sekwencje na DNA tzw "origin" (ori): - wiązania białek inicjatorowych, - rozdzielenia nici i rozpoczęcia procesu replikacji, - przyłączania białek wspomagających proces replikacji. Miejsce kontroli replikacji. Raz rozpoczęty proces musi przebiegać aż do zakończenia syntezy całego replikonu. U bakterii replikon obejmuje cały genofor, a więc pojedyncze miejsce inicjacji kontroluje replikację całego genomu.

Organizmy eukariotyczne -wiele replikonów w każdym chromosomie. Dzięki tej różnicy szybkość replikacji genomu eukariota wielokrotnie przewyższa szybkość replikacji genomu prokariota.

Rozdzielające się w miejscu syntezy łańcuchy matrycowego DNA tworzą tzw. "widelki replikacyjne". O rozdzieleniu heliksu DNA decydują białka enzymatyczne zwane helikazami. Wykorzystuja one energię hydrolizy ATP do zmiany kształtu swojej cząsteczki, co umożliwia im wykonanie pracy mechanicznej.

Helikazy przesuwają się wzdłuż dwuniciowego DNA, rozdzielając nici i poszerzając widełki replikacyjne.

~200 pz

Fragmenty Okazaki

Kierunek postępowania widełek replikacyjnych

Nić potomna

Fragmenty Okazaki

Najważniejszymi enzymami odpowiedzialnymi za replikację DNA są polimerazy DNA. Nie maja zdolności do samodzielnego rozpoczęcia syntezy łańcuchów

DNA, mogą jedynie je wydłużać. Z tego powodu synteza DNA zaczyna się od wbudowywania starterowych odcinków RNA, które zakończone są wolną grupą OH, na koncu 3'. Za wbudowywanie tych odcinków odpowiedzialne są

wyspecjalizowane enzymu zwane primazami. Etapy inicjacji replikacji:

przyłączenie się helikaz do odpowiednich sekwencji inicjatorowych, rozplatanie podwójnego heliksu i powstanie widełek replikacyjnych, synteza starterowych odcinków RNA przez primazy

Elongacja replikacji Enzymy pomocnicze (rozplatanie i stabilizacja nici, wbudowywanie starterów) tworzą kompleks tzw. replisom. Polimerazy syntetyzujące potomne nici DNA nie tylko nie są zdolne do rozpoczęcia replikacji, lecz również przyłączanie przez nie nukleotydów może się odbywać wyłącznie do grup -OH (konca 3') starterów RNA.

W fazie elongacji procesu replikacji bierze udział kilka polimeraz, różniących się funkcjonalnie:

polimeraza I - jej rola jest usuwanie odcinków starterowych z fragmentów Okazaki oraz wycinanie uszkodzonych odcinków DNA w procesie naprawy, polimeraza II - funkcja metaboliczna tego enzymu nie jest dokładnie poznana, wiadomo natomiast, ze wykazuje aktywność egzonukleolityczną, polimeraza III - jest właściwa replikaza DNA, jej główna funkcją jest wstawianie nowych nukleotydów na końcu 3' nowopowstającej nici DNA.

Terminacja replikacji

dochodzi do połączenia DNA w kompletne chromosomy i rozdzielenia ich pomiędzy komórki potomne. U organizmów prokariotycznych, gdzie na kolistym genoforze znajduje się tylko jeden replikon, za końcowy etap replikacji odpowiadają 4 sekwencje nukleotydowe, wiążące się z białkiem terminacyjnym. Białko

to będąc inhibitorem replikacji, hamuje cały proces. U eukariontów z powodu kilku miejsc inicjacji replikacji do zakończenia replikacji wystarczy fizyczne zetkniecie się dwóch podążających ku sobie w przeciwnych kierunkach widełek replikacyjnych. Nie potrzeba tu

specjalnych sekwencji terminalnych.

Gdyby replikacja u organizmów eukariotycznych kończyła się analogicznie do prokariota to ostatni kilkunukleotydowy fragment pozostawałby niedoreplikowany. Na końcu każdego chromosomu istnieją jednak charakterystyczne sekwencje, które pozwalają na utrzymanie niezmiennej długości genomów - telomery.

Telomery odpowiadają również za ochronę DNA przed łączeniem się z innymi chromosomami. Replikacja telomerów zachodzi w sposób odmienny od reszty chromosomu. Odpowiada za nie specjalny enzym zwany telomerazą. Terminacja replikacji: - zakończenie syntezy nowych nukleotydów w odpowiednich miejscach, - połączenie powstałego DNA w kompletne chromosomy, - rozdzielenie chromosomów pomiędzy komórki potomne.

Polimeraza DNA błędny nukleotyd wstawia raz na 109.

Jeśli diploidalna komórka ludzka zawiera ok. 3 miliardów par zasad (DNA jądrowego), w czasie jednej rundy replikacyjnej zaledwie kilka (do kilkunastu) nukleotydów jest wbudowanych mylnie. Tak wysoka wierność replikacji wynika z korekcyjnej aktywności polimerazy.

Podsumowując: 1. Replikacja to proces podwajania ilości DNA przed nastąpieniem podziału komórkowego.

2. W czasie replikacji - dzięki istnieniu mechanizmów kontrolujących poprawność włączania kolejnych nukleotydów - informacja zawarta w macierzystym DNA zostaje skopiowana z dużą dokładnością. 3. Ogólny schemat replikacji jest taki sam dla Procaryota i Eucaryota, a istniejące różnice wynikają przede wszystkim z wielkości i sposobu upakowania genomu obu grup organizmów.

TRANSKRYPCJA

TRANSKRYPCJA

Transkrypcja to proces, w którym informacja zawarta w DNA zapisana w formie sekwencji deoksyrybonukleotydów - przepisana zostaje na język rybonukleotydów pre-mRNA podczas reakcji katalizowanej przez enzym zwany polimerazą II RNA. Trzy etapy: inicjacja transkrypcji, elongacja łańcucha pre-mRNA terminacja

Inicjacja transkrypcji Gen oprócz obszaru transkrybowanego zawiera jeszcze promotor i terminator odpowiednio na swoim 5' i 3' końcu, przy czym jedno i drugie należy pojmować raczej jako obszary funkcjonalne, a nie jedynie strukturalne.

Inicjacja transkrypcji to ten moment, w którym odbywa się najbardziej precyzyjna kontrola ekspresji. To, czy dany gen w konkretnej komórce zostanie w danym momencie wyrażony, tzn. czy zostanie zsyntetyzowane określone białko, zależy w głównej mierze od tego, czy transkrypcja zostanie zapoczątkowana. Zdarza się, że transkrypcja zachodzi, ale na dalszych etapach ekspresja zostaje wygaszona, czego skutkiem jest brak syntezy białka. Jednakże generalnie inicjacja transkrypcji jest głównym punktem kontrolnym ekspresji.

Inicjacja - zachodzi w obrębie promotora, a także daleko położonych rejonów (enhancery), które umożliwiają polimerazie II RNA podjęcie działania. W przeciwieństwie do prokariontów polimeraza II RNA wymaga do

zapoczątkowania reakcji obecności czynników transkrypcyjnych tzw. TF-ów (ang. transcription factors), które wiążą się do DNA w obrębie promotora, enhancerów bądź silencerów. Ich obecność lub brak w danej komórce (czy tkance) decyduje w znacznej mierze o rozpoczęciu (lub nie) transkrypcji konkretnego genu. Oprócz białek na transkrypcję mogą również wpływać hormony.

Jakkolwiek TF-y są istotne w regulacji ekspresji informacji genetycznej, i tak najważniejsza jest struktura chromatyny. To, czy dany gen jest łatwo czy trudno dostępny zależy od tego jaka jest struktura chromatyny w rejonie, w którym występuje. Im silniejsza jest jej kondensacja tym mniejsza możliwość przyłączenia enzymu. W różnych tkankach różne rejony DNA są mocno skondensowane (heterochromatyna). Tak więc, jeżeli wiadomo, że konkretny gen w danej tkance nie ulega transkrypcji z dużym prawdopodobieństwem można stwierdzić, że obszar w którym się lokuje jest niedostępny dla aparatu transkrypcyjnego.

EU

Rejony DNA o funkcjach regulacyjnych

Sterowanie transkrypcją - przez związanie czynników białkowych czy hormonalnych - może odbywać się z różnych miejsc na DNA. Miejsca te mogą leżeć w obrębie genów (promotory), lub też w odległości kilku tys. nukleotydów (enhancery, silencery).

Promotory Obszar promotorowy genu znajduje się na jego 5' końcu i zawiera kilka istotnych rejonów rozpoznawanych przez polimerazę II RNA (najbliżej miejsca startu transkrypcji) oraz czynniki transkrypcyjne.

Najistotniejsza sekwencja - kaseta TATA (tzw. TATA-box). Jest to 7nukleotydowa sekwencja położona w odległości ok. 25 p.z. od miejsca startu transkrypcji: 5'- TATAAAA -3'. Obecność kasety TATA, choć niezbędna w przypadku prawie wszystkich genów; nie jest wystarczająca. Do pełnej aktywności promotora niezbędne są inne sekwencje występujące w rejonie od -110 do -40 od startu transkrypcji.

Enhancery i silencery Enhancery to sekwencje wzmacniające aktywność promotorów. Położone mogą być nawet w znacznej odległości od genu i zachowują zdolność regulacyjną także po eksperymentalnej

zmianie orientacji o 180ºC względem genu. Do enhancerów wiążą się czynniki transkrypcyjne określane jako aktywatory, które oddziałują z polimerazą II RNA i TF-ami promotorowymi. Możliwość oddziaływań enhancer : promotor mimo odległości pomiędzy nimi wynoszącej niekiedy kilka Kpz istnieje dzięki dużej elastyczności nici DNA.

Enhancery – tylko w niektórych komórkach wykazują aktywność wzmacniającą.

Jest to znaczący fakt w regulacji ekspresji informacji genetycznej, a bierze się on z różnic w składzie białek komórkowych poszczególnych tkanek. Istnieją enhancery tkankowo-specyficzne wzmagające transkrypcję

tylko tam, gdzie obecne są białka wiążące się w ich obrębie. Enhancery mają także istotne znaczenie w regulacji transkrypcji

przez hormony steroidowe.

Silencery - ( ang. silence - cisza ), sekwencje służące wyciszeniu aktywności promotora; podobnie jak enhancery mogą być w różnym stopniu oddalone od genu w obu kierunkach, a także występować w jego wnętrzu. W przypadku regulacji transkrypcji genów immunoglobulin (białek syntetyzowanych jedynie w limfocytach B) silencer wbudowany jest w obrębie enhancera, a jego znaczenie uwidacznia się w komórkach

innych niż limfocyty B. Jest to swoiste zabezpieczenie przed ekspresją genów immunoglobulin w innych komórkach, związane z inaktywacją enhancera.

Nazwa czynnika

Funkcje

TFIID - TBP

Przyłączanie się do TATA box ( rozluźnianie helisy DNA ) Umożliwianie TFIIB przyłączania się do DNA Regulacyjne ( aktywacja, represja )

TFIIB

Umożliwianie łączenia się kompleksu polimerazy i TFIIF z DNA

TFIIF

Kierowanie polimerazy II RNA do promotora

TFIIE

Stymulacja aktywności TFIIH

TFIIH

Rozplatanie helisy DNA (aktywność helikazy ) Dostarczanie energii niezbędnej do zajścia reakcji ( hydroliza ATP ) Fosforylacja polimerazy ( modyfikacja aktywująca enzym )

1.Inicjacja transkrypcji jest momentem najbardziej precyzyjnej kontroli ekspresji genu. 2. Transkrypcja może zachodzić na różnych poziomach: podstawowym (niskim), zaktywowanym (intensywnym) w zależności od składu czynników ranskrypcyjnych w danej tkance.

3. Regulacja transkrypcji zależna jest do czynników: wewnętrznych (struktura chromatyny w rejonie występowania określonego genu, obecność kompletu TF-ów); zewnętrznych - odpowiedź sprowokowana bodźcami ze środowiska np. hormonalna.

Obróbka pre-mRNA Polega na wycięciu intronów oraz (co jest charakterystyczne dla większości pre-mRNA) dodaniu na 3' końcu długiego fragmentu tzw. poli A.

Poliadenylacja Większość produktów reakcji katalizowanej przez polimerazę II RNA zawiera na swoim 3' końcu tzw. ogon poli A, tj. ciąg liczący od 100 do 250 połączonych ze sobą nukleotydów adeninowych. Fragment poli A nie jest efektem transkrypcji, a jedynie posttranskrypcyjnej modyfikacji, w której udział bierze enzym zwany polimerazą poli A.

Wycinanie intronów Zanim powstanie ostateczny, dojrzały mRNA mogący ulec translacji, pre-mRNA musi zostać pozbawiony intronów - splicing. Z porównywania sekwencji różnych intronów wynika, że łączą je następujące podobieństwa: na 5' końcu zawierają zawsze kolejno: resztę guaninową i uracylową (5'- GU) na ich 3' końcu występuje reszta guaninowa poprzedzona resztą adeninową (AG - 3') wewnątrz zawierają tzw. miejsce rozgałęzienia, w którym kluczową dla splicingu rolę odgrywa nukleotyd adeninowy.

Mechanizm splicingu 1. Rozcięcie cząsteczki pre-mRNA w miejscu splicingowym 5' (tj. na 5' końcu intronu).

2. Atak grupy 2'-OH nukleotydu adeninowego (z miejsca rozgałęzienia) na 5' grupę fosforanową nukleotydu guaninowego intronu. 3. Atak uwolnionej grupy 3'-OH eksonu 1 na 5' grupę fosforanową eksonu 2 z uwolnieniem intronu mającego postać lassa.

Podsumowując: 1. Pre-mRNA zanim stanie się pełnowartościową matrycą do syntezy białka musi przejść przez proces dojrzewania. 2. Dojrzewanie obejmuje 3 zasadnicze modyfikacje: - capping (dodawanie czapeczki) - poliadenylację podnoszącą stabilność transkryptu; - splicing, w którym eliminowane są wewnętrzne niekodujące rejony informacyjnego RNA. 3. Alternatywny splicing i poliadenylacja mogą generować różne produkty (mRNA) wykrywane w różnych tkankach, co znaczy, że jeden gen może kodować więcej niż jedno białko. 4. Dojrzewanie pre-mRNA jest warunkiem eksportu transkryptu z jądra. 5. Dojrzały mRNA wiąże się z białkami mającymi wpływ na jego stabilność, transport i translację.

CZYNNIKI USZKADZAJĄCE DNA: 1. PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE:  np. promieniowanie rentgenowskie, może wybijać elektrony z atomów, tworząc elektrycznie naładowane jony, które umieszczone wewnątrz lub w sąsiedztwie cząsteczki DNA mogą promować reakcje chemiczne zmieniające ładunek zasad DNA.  Promieniowanie jonizujące może przerwać nić DNA

2.PROMIENIOWANIE NIEJONIZUJĄCE:

 np. promieniowanie UV powodujące tworzenie się wiązań kowalencyjnych pomiędzy przylegającymi zasadami pirymidynowymi (cytozyną lub tyminą)

3. ZWIĄZKI CHEMICZNE 

np. kwas azotawy – usuwający grupy aminowe z cytozyny i przekształcający ją w uracyl. Chociaż uracyl jest normalnie znajdowany w RNA, naśladuje on tyminę w łączeniu zasad w DNA



Analogi zasad – np. 5-bromouracyl – mogą być podstawiane za prawdziwe zasady w procesie replikacji



Barwniki akrydynowe mogą fizycznie wbudować się pomiędzy istniejące zasady, odkształcając spiralę DNA i powodując mutację typu zmiany ramki odczytu

NAJCZĘSTSZE USZKODZENIA DNA : 1. PRZERWANIE NICI DNA 2. DIMERYZACJA SĄSIADUJĄCYCH ZE SOBĄ ZASAD PIRYMIDYNOWYCH (T=T) 3. DEAMINACJA CYTOZYNY Z JEJ PRZEKSZTAŁCENIEM W URACYL

NAPRAWA PRZERWANEJ NICI DNA Promieniowanie jonizujące, niektóre związki chemiczne, oraz przypadkowe działanie np. endonukleazy może powodować pęknięcie jendej nici.

Uszkodzenie takie naprawiane jest przez LIGAZĘ DNA.

Po wycięciu frg. uszkodzonego Polimeraza DNA zsyntetyzuje brakujący fragment łańcucha. Koniec 3’ uszkodzonej nici jest starterem tej syntezy, a nietknięta nić stanowi matrycę dla polimerazy.

Nowo powstały odcinek DNA zostanie połączony za pomocą ligazy DNA

KARODERMIA Jest to defekt metaboliczny, polegający na braku endonukleazy, która hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe w sąsiedztwie dimeru pirymidynowego. Następstwem tego jest atrofia skóry i skłonność do nowotworów skóry.

USZKODZENIA SYSTEMÓW NAPRAWY DNA Uszkodzenia tego systemu, prowadzą do wielu chorób między innymi nowotworowych. Niepolipowy rak okrężnicy i odbytnicy jest wynikiem uszkodzenia procesu rozpoznawania i korygowania w DNA niewłaściwie parowanych nukleotydów XERODERMA PIGMENTOSUM – brak systemu niszczącego dimery pirymidynowe. Jest to choroba skóry – obecne piegowatości, guzy, nieprawidłowe zabarwienie. Powodowana ekspozycją na promieniowanie ultrafioletowe

Zespół Cockayne’a Choroba powodowana zaburzeniami naprawy uszkodzeń powodowanych przez UV w DNA aktywnym transkrypcyjnie. Cechy – chorzy są niskiego wzrostu, nieprawidłowości w budowie szkieletu, atrofia narządu wzroku, głuchota, wrażliwość na światło słoneczne, opóźnienie umysłowe.

Upośledzenie zdolności naprawy pęknięć dwuniciowego DNA może prowadzić do nowotworów sutka i jajnika

Pewne białka, które w różnych organizmach pełnią taką samą funkcję, mają również bardzo podobne sekwencje aminokwasowe.

Odkrycie to dowiodło, że wiele różnych rodzajów organizmów miało wspólną przeszłość ewolucyjną.