MO cw. 8 i 9_Biotech

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

Ćwiczenia 8 i 9 Temat: Metabolizm bakterii (cz. 2) Właściwości glikolityczne, lipolityczne, proteolityczne i oksydo-redukcyjne – posiew.

I.

CZĘŚĆ TEORETYCZNA:

1) Rozkład tłuszczów przez drobnoustroje. 2) Rozkład białek i aminokwasów przez drobnoustroje. 3) Oddychanie tlenowe i beztlenowe 4) Fermentacja (homo- i heterofermentacja).

Literatura: 1. Różalski A. 2003. Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Wyd. U. Łódzkiego, Łódź. 2. Temat 2 pt. „Metabolizm mikroorganizmów” kursu e-learningowego „Wykorzystanie mikroorganizmów w ochronie środowiska” dostępny na platformie uniwersyteckiej UŚ pod adresem: http://el.us.edu.pl/upgow/course/view.php?id=39.

II.

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA:

Właściwości glikolityczne, lipolityczne, proteolityczne i oksydoredukcyjne bakterii – posiew.

1. Właściwości glikolityczne bakterii: a) posiać szczepy Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens oraz Bacillus subtilis na mały szereg cukrowy (glukoza, maltoza, laktoza, sacharoza, mannitol), - po okresie inkubacji sprawdzić wykorzystywanie cukrów przez badane bakterie - zmiana barwy wskaźnika z zielonej na żółtą świadczy o wykorzystaniu badanego cukru.

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

1

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

Fot. Wykorzystanie testowanych cukrów przez E.coli (po lewej) i P.fluorescens - Po okresie inkubacji obserwacje zanotuj w tabeli:

Bakterie

Szereg cukrowy Glc

Mal

Lac

Sac

Man

E. coli P. fluorescens B. subtilis

Wniosek:

b) posiać szczepy (posiew redukcyjny) Escherichia coli oraz Pseudomonas fluorescens na płytkę Endo. Podłoże Endo jest podłożem różnicującym, zawierającym laktozę, jako źródło węgla, fuksynę zasadową i siarczyn sodowy redukujący fuksynę do bezbarwnej

leukozasady.

Niektóre

drobnoustroje

fermentują

laktozę

z

wytworzeniem aldehydu octowego, który z obecną leukozasadą tworzy barwny Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

2

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

kompleks. Kolonie E.coli przybierają ciemno-czerwone zabarwienie z metalicznym połyskiem, co jest wynikiem rozkładu laktozy przez te pałeczki. -

Po inkubacji opisać wzrost E. coli i P. fluorescens na podłożu Endo.

Fot. Wzrost E.coli (po lewej) i P. fluorescens (po prawej) na podłożu Endo Obserwacje:

Wniosek:

-

posiać Escherichia coli, Staphylococcus aureus i S. epidermidis na płytkę Chapmana. Na podłożu tym rosną drobnoustroje tolerujące 8% stężenie NaCl i wykorzystujące mannitol jako źródło węgla. S. aureus w warunkach tlenowych i względnie beztlenowych wyrasta w postaci kolonii otoczonych żółtą strefą powstałą w wyniku rozkładu mannitolu i zakwaszenia środowiska. S. epidermidis nie rozkłada mannitolu i rośnie w postaci białych kolonii nie powodując zmiany barwy podłoża.

-

Po inkubacji opisać wzrost bakterii rosnących na podłożu Chapmana

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

3

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

Fot. Wzrost Staphylococcus aureus (po lewej) na podłożu Chapmana i brak wzrostu bakterii kontrolnej (E.coli, po prawej) Obserwacje:

Wniosek:

c) posiać Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens oraz Bacillus subtilis na podłoże Hugh-Leifsona z parafiną i bez parafiny. Na podłożu tym: 1. 2. 3.

Bakterie niezdolne do rozkładu cukru (glukoza) nie zmieniają barwy podłoża. Bakterie wykorzystujące cukier w warunkach tlenowych zmieniają barwę podłoża tylko w probówce bez parafiny. Bakterie utleniające i fermentujące cukier powodują zmianę zabarwienia z zielonej na żółtą (zakwaszenie podłoża) w obu probówkach.

Obserwacje:

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

4

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

Wniosek:

d) posiać Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens oraz Bacillus subtilis na podłoże Clarka (próba VP i MR). Próby VP i MR są stosowane do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaeae, które prowadzą rozkład glukozy z wytworzeniem wielu produktów pośrednich. W zależności od gatunku bakterii są one wytwarzane w różnych stosunkach ilościowych. Dlatego, wyróżniamy dwa typy fermentacji. W pierwszym przypadku powstają głównie kwasy organiczne ( m. in. acetoina). Jest to typ fermentacji charakterystyczny dla E. coli, dodatni wynik MR. W drugim, przeważa produkcja 2,3 butanodiolu. Charakterystyczny dla Enterobacter sp. Dodatni wynik VP. -

Po inkubacji:



wykonać próbę MR [MR – methyl red] – sprawdzenie stopnia zakwaszenia podłoża (określenie typu fermentacji): Do hodowli dodać kilka kropli roztworu czerwieni metylowej. Jeśli pH jest niższe niż 4,5 pożywka zabarwia się na czerwono (odczyn MR dodatni), jeżeli pH jest wyższe niż 4,5 barwa podłoża pozostanie żółta (odczyn MR ujemny). o Wskaźnik czerwieni metylowej pozwala na wykrycie końcowych produktów rozkładu glukozy takich jak kwas mlekowy, kwas octowy, kwas mrówkowy i inne kwasy. Powoduje to zakwaszenie podłoża a tym samym pojawienie się dodatniego odczynu MR.



wykonać próbę VP (odczyn Voges-Proskauera) – sprawdzenie wytwarzania acetoiny. Do hodowli dodać 0,6 ml 6% roztworu -naftolu, 0,4 ml 40% wodnego roztworu KOH. Probówkę parokrotnie wstrząsnąć i umieścić na 30 minut w łaźni wodnej w temp. 37oC. Czerwone lub wyraźnie różowe zabarwienie w górnej części podłoża świadczy o wytwarzaniu acetoiny prekursora 2,3 butanodiolu (odczyn dodatni).

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

5

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

Fot. Wynik pozytywny dla próby MR (z lewej) i negatywny dla próby VP (z prawej)

Obserwacje:

Wniosek:

e) posiać Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens oraz Bacillus subtilis na podłoże Kliglera. Podłoże to jest głównie używane do orientacyjnej identyfikacji pałeczek jelitowych

(Enterobacteriaceae).

Jest

również

stosowane

do

odróżnienia

Enterobacteriaceae od innych bakterii Gram-ujemnych. Pozwala ono na wykrycie fermentacji glukozy, laktozy, jak również wytwarzania siarkowodoru (H2S) i gazu. Zawiera pepton, laktozę, glukozę oraz siarczek żelaza, siarczan amonu lub tiosiarczanu sodu. Wskaźnikiem pH jest czerwień fenolowa. W zależności od pH następuje zmiana barwy podłoża - w pH poniżej 6,4 na kolor żółty (zakwaszenie), w pH powyżej 8,2 na czerwony (alkalizacja). 1. Niezmieniona barwa podłoża oznacza brak fermentacji obu cukrów. 2. Żółty skos i żółty słupek (zakwaszenie podłoża) oznacza fermentację laktozy i glukozy. 3. Powstawanie baniek gazu wewnątrz podłoża (niekiedy jego rozerwanie), wskazuje na wytwarzanie gazu.

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

6

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

4. Czerwony skos i żółty słupek oznacza fermentację glukozy i brak fermentacji laktozy. Początkowo rozkładana jest glukoza - dochodzi do zakwaszenia podłoża (żółta barwa). Następnie, rozkładane są aminokwasy zawarte w peptonie alkalizując środowisko – czerwone zabarwienie skosu. 5. Zaczernienie podłoża oznacza wytwarzanie siarkowodoru. Obserwacje:

Wniosek:

2. Sprawdzanie właścicowści lipolitycznych bakterii: a) posiać Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens oraz Bacillus subtilis na podłoże z tłuszczem. -

Po inkubacji powierzchnię podłoża z tłuszczem zalać roztworem CuSO4. Powstanie barwnego (szmaragdowego) kompleksu w pobliżu wzrostu bakterii świadczy o rozkładzie tłuszczu.

Fot. Rozkład tłuszczów na płytce posianej B. subtilis Obserwacje:

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

7

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

Wniosek:

3. Badanie właściwości proteolitycznych bakterii: a) Wytwarzanie enzymów proteolitycznych. Wykonać posiew Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis płytkę Fraziera. -

Po inkubacji powierzchnię podłoża Fraziera zalać roztworem HgCl2 w HCl. Wokół kolonii rozkładających żelatynę powstaje strefa przejaśnienia. Gatunek bakterii

Obecność strefy przejaśnienia

Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Wniosek:

b) Wytwarzanie indolu z tryptofanu. Wykonać posiew Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis podłoże z tryptofanem. Tryptofan jest aminokwasem, który znajduje się prawie we wszystkich białkach. Bakterie wytwarzające enzym tryptofanazę są zdolne do hydrolizy tryptofanu z wytworzeniem indolu, który gromadzony jest w podłożu. -

Po inkubacji sprawdź obecność tryptofanu poprzez nawarstwienie odczynnika Kovácsa (p-dimetyloaminobenz-aldehyd w alkoholu amylowym i stężonym HCl) - pojawienie się w ciągu kilku minut ciemnowiśniowego pierścienia świadczy o obecności indolu w podłożu. Bakterie: Tryptofan  indol + kwas pirogronowy + amoniak

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

8

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia Reakcja z odczynnikiem Kovácsa: Indol + p-dwumetyloaminobenzaldehyd

HCl + alkohol amylowy

2016/2017

czerwony pierścień

Odczynnik Kovácsa

Fot. Pojawienie się ciemniowiśniowego pierścienia świadczącego o obecności indolu w podłożu - Po okresie inkubacji obserwacje zanotuj w tabeli: Gatunek bakterii

Obecność ciemnowiśniowego pierścienia

Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Wniosek:

c) Dekarboksylacja aminokwasów. Wykonać posiew Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis podłoże Falkowa z lizyną i kontrolne bez lizyny (pod parafiną). Zdolność bakterii do dekarboksylacji aminokwasów w warunkach beztlenowych bada się na podłożu Falkowa zawierającym aminokwas (substrat), glukozę oraz purpurę bromokrezolową (wskaźnik). Po inkubacji oceniamy wzrost i zmianę barwy w probówce bez aminokwasu (kontrola) i z aminokwasem.

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

9

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

A

B

2016/2017

A. Wykorzystanie glukozy prowadzi do zakwaszenia podłoża, co objawia się zmianą barwy z fioletowej na żółtą, zaś wtórna alkalizacja zachodząca w wyniku dekarboksylacji aminokwasów przywraca pożywce barwę wyjściową (fioletową). Wystąpienie fioletowej barwy podłoża z aminokwasem i żółtej w probówce kontrolnej świadczy o wyniku dodatnim. B. W przypadku reakcji ujemnej obydwie probówki pozostają żółte.

- Po okresie inkubacji obserwacje zanotuj w tabeli: Gatunek bakterii

Zabarwienie Podłoża Falkowa z lizyną

bez lizyny

Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Ż – żółte, F – fioletowe Wniosek:

d) Deaminacja fenyloalaniny. Wykonać posiew Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis podłoże z fenyloalaniną. -

Po okresie inkubacji na powierzchnię hodowli bakterii (na podłożu z

fenyloalaniną) nanieść 10% roztwór chlorku

żelazowego. W przypadku

wytworzenia przez bakterie kwasu fenylo-pirogronowego, pojawia się zielone zabarwienie. Obserwacje zanotuj w tabeli: Gatunek bakterii

Obecność zielonego zabarwienia

Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Wniosek:

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

10

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

4. Badanie właściwości oksydoredukcyjnych bakterii: Wykonać posiew Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis na podłoże płynne i skos. -

Po okresie inkubacji sprawdzić obecność: a) dehydrogenazy – do hodowli bulionowej dodać 1% roztwór błękitu metylenowego. Po półgodzinnej inkubacji ocenić odbarwienie pożywki. Błękit metylenowy może pełnić rolę “sztucznego” akceptora protonów i elektronów pochodzących z różnych substratów.

Podlega

on

wtedy

redukcji

do

bezbarwnego

leukozwiązku.

Przenoszenie protonów i elektronów uwarunkowane jest obecnością dehydrogenaz u drobnoustrojów. Obserwacje zanotuj w tabeli: Gatunek bakterii

Odbarwienie pożywki

Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Wniosek:

b) oksydazy cytochromowej. Z hodowli na skosie agarowym pobrać niewielką ilość drobnoustrojów

i

przenieść

na

bibułę

nasączoną

odczynnikiem

“NADI”

(chlorowodorek dimetylo-p-fenylodwuaminy i -naftolu). Powstanie niebieskiego zabarwienia świadczy o obecności oksydazy cytochromowej.

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

11

Karta pracy z Mikrobiologii ogólnej dla studentów II roku kierunku Biotechnologia

2016/2017

Fot. Niebieskie zabarwienie świadczące o obecności oksydazy cytochromowej Obserwacje zanotuj w tabeli: Gatunek bakterii

Obecność niebieskiego zabarwienia

Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Wniosek:

c) katalazy: Na 24-godzinną hodowlę bakterii na skosie agarowym nanosimy 3% roztwór wody utlenionej. Pojawiające się pęcherzyki gazu (tlen) świadczą o wytwarzaniu katalazy. Obserwacje zanotuj w tabeli: Gatunek bakterii

Obecność pęcherzyków gazu

Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Wniosek:

Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach

12