Biologia molekularna w cytologii 26-02-2013

Biologia molekularna w cytologii Prof. Piotr Rieske Zakład Biologii Nowotworów

Techniki Biologii Molekularnej • • • • • • • • • •

PCR RT-PCR (reverse) (real time) RT-PCR beacons LOH RFLP Sekwencjonowanie Masywne równoległe sekwencjonowanie FISH (cytogenetyka) PCR-PNA ASO-PCR (utrudniona standaryzacja) Badania mikromacierzowe Rzadko stosowane w typowych badaniach cytologicznych (potrzebne duże ilości mRNA) • Western blotting

Mutacja genu P53 PCR-SSCP

K- k+

Sekwencjonowanie

A CGT

komórki nowotworowe

kodon 245 GGCAGC GlySer

A CGT

Kontrola ujemna

Utrata heterozygotyczności

Utrata heterozygotyczności polimorficznego allelu DNA, który jest oznakowany dwiema strzałkami. Całkowita utrata jednego allelu występuje u pacjentów 1 i 2, częściowa utrata u pacjenta 3 i brak utraty wskazujący na inny mechanizm u pacjenta 4. S- tkanka somatyczna, T- tkanka guza

LOH 17p13.1 (P53)

Guz Krew

RFLP-PCR

ASP PCR

Sekwencjono -wanie

Automatyzacja

Next generation sequencing

RT-PCR • Dążenie do prostoty • Olbrzymia czułość (czasem zbyt duża)

Real time PCR i problem czułości Przejście od metod jakościowych do półilościowych i ilościowych.

14-3-3 PrP vs. PrP sc

Rozwój nowotworu w tkance nabłonkowej

Mutacje niezbędne do przeprowadzenia komórki normalnej w nowotworową tworzą tor mutacyjny

Tor mutacyjny prowadzący do raka jelita grubego

Typy markerów nowotworowych markery nowotworowe – mutacje w genach toru mutacyjnego markery klonalności – rearanżacja genów immunoglobulinowych i receptorów limfocytów T oraz geny fuzyjne powstałe w wyniku aberracji chromosomowych markery ekspresji tkankowo specyficznej – transkrypty genów ulegających ekspresji jedynie w określonym typie komórek (tyrozynaza)

Zastosowanie markerów genetycznych 

 

  

Diagnozowanie chorób nowotworowych Badanie klonalności Prognozowanie przebiegu choroby Wybór terapii Monitorowanie terapii Badanie predyspozycji do zapadalności na choroby nowotworowe

Translokacja fragmentu ramienia długiego chromosomu 9 na ramię długie chromosomu 22 [t(9;22)(q34;q11)]. W czasie translokacji fragment onkogenu ABL zostaje przeniesiony na chromosom 22 w rejon BCR (chromosom Ph). Do fragmentu genu ABL pozostającego na chromosomie 9, przemieszcza się odcinek chromosomu 22 z fragmentem sekwencji BCR. Gen fuzyjny ABL/BCR – kinaza tyrozynowa o silnych właściwościach transformujących (Test!)

Czułość Metod

Schemat organizacji genów łańcucha ciężkiego gamma. LH – geny kodujące peptyd liderowy, VH – geny części zmiennej łańcucha ciężkiego, CH – geny części stałej łańcucha ciężkiego, JH – geny łączące, DH – geny różnorodności

Kierowana terapia Ostra białaczka promielocytarna T 15;17

Poszukiwanie w moczu markerów genetycznych CDKN2a CDKN2b

Pap rozmaz HPV infekcja

Papanicolau infekcja aktywna RT-PCR, także latentna odmiany HPV

Test!

BCR-Abl

Metastaza, Opis pola Mikrodysekcja

• Tyreoglobulina Rak tarczycy

Opis pola- Określenie miejsce zasięgu procesu nowotworowego w okolicy zmiany pierwotnej. Do opisu pola stosuje się metody biologii molekularnej umożliwiające wykrycie zmian w komórkach które wykazują subtelne zmiany patomorfologiczne lub w komórkach które takich zmian nie wykazują. Mikrodysekcja polega na selekcjonowaniu grup komórek albo nawet pojedynczych komórek w celu wyizolowania z nich kwasów nukleinowych.

Ślina K-ras Rak płuca

Prostata Markery w nasieniu Zaawansowanie procesu Poszukiwanie mRNA (DNA) we krwi

Rak pęcherza markery w moczu • FISH alteracje cytogenetyczne Aneuploidie chromosomów 3,7,17 Utrata 9p21. • PCR PNA Mutacje P53

Bioptaty

Immunocytochemia Immunohistochemia

Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa

The SSC detects light at a 90 degree angle to the laser source point; this scatter gives information on granularity and internal complexity. Below are two diagrams, the first shows how light interacts with the particle to create side scattter, followed by a close up of detailed internal interaction

Histogram

Histogram dwuparametrowy np. wielkość komórek i wiązanie przeciwciał

Sortowanie

Podsumowanie • Jakie metody stosujemy? Jakie są ich wady i zalety? • Dlaczego łatwiej wykryć translokację niż mutację punktową? • Na czym polega mikrodyskecja? • Na czym polega ocena pola. • Przykładowe aplikacje. • Na czym w zarysie polega cytometria przepływowa?