cw 2 Ocena ilosciowa reakcji antygen-przeciwcialo

Ocena ilościowa reakcji antygen - przeciwciało

Mariusz Kaczmarek

Metody ilościowe oparte na tworzeniu immunoprecypitatów • • • •

immunodyfuzja radialna wg Mancini immunoelektroforeza rakietowa wg Laurella turbidymetria nefelometria

Podstawy molekularne tworzenia kompleksów immunologicznych

przeciwciała

rozpoznanie

antygeny

agregacja

precypitacja

Immunodyfuzja radialna wg Mancini

antygeny

żel z przeciwciałami

wg Orczyk-Pawiłowicz, Kątnik-Prstowska

Immunodyfuzja radialna wg Mancini średnica kręgów precypitacyjnych

wg Orczyk-Pawiłowicz, Kątnik-Prstowska

średnica precypitatu (d lub d2)

Immunodyfuzja radialna wg Mancini - krzywa wzorcowa

stężenie antygenu (μg/ml)

Immunodyfuzja radialna wg Mancini - zastosowanie Materiał: surowica, osocze, mocz, PMR, płyn owodniowy Oznaczane białka: albumina, składowe dopełniacza, kwaśna α1-glikoproteina, α1-antychymotrypsyna, apolipoproteina, CRP, haptoglobina, ceruloplazmina, transferyna, fibronektyna, lizozym, immunoglobuliny (IgG, -A, -M, -D, -E), podklasy immunoglobulin (IgG1-4, IgA1-2), łańcuchy lekkie Ig κ, λ

Immunoelektroforeza rakietowa wg Laurella żel z przeciwciałami

+

− antygeny

precypitaty

Immunoelektroforeza rakietowa wg Laurella - zastosowanie Materiał: surowica, PMR Oznaczane białka: apolipoproteina

Koloidy Roztwory niejednorodne składające się z fazy rozpraszanej i rozpraszającej. Rozpuszczone w wodzie białka, polisacharydy, lipidy, kwasy nukleinowe tworzą roztwory koloidowe.

Turbidymetria Pomiar światła przechodzącego przez zawiesinę

źródło światła

fotodetektor

Nefelometria Pomiar światła rozproszonego przez zawiesinę źródło światła

45° lub 90°

fotodetektor

Warunki reakcji 1. Prawidłowe przygotowanie roztworów 2. Temperatura 3. Jakość analizowanego materiału • bez elementów komórkowych i związków barwnych • czysty pod względem bakteriologicznym • oczyszczone przeciwciała

turbidancja

Krzywa standardowa

stężenie antygenu (μg/ml)

Modyfikacje karboksylowany lateks - oznaczanie antygenów - oznaczanie przeciwciał Przykłady testów: •

CRP

•

RF klasy IgM

•

ASO

Turbidymetria i nefelometria - zastosowania Materiał: surowica, osocze, mocz, PMR, płyn owodniowy Oznaczane białka: albumina, składowe dopełniacza C3c i C4, haptoglobina, ceruloplazmina, transferyna, fibronektyna, lizozym, immunoglobuliny (IgG, -A, -M), łańcuchy lekkie Ig κ, λ, β2-mikroglobulina, apolipoproteina, RF, CRP, hemoglobina, czynniki krzepnięcia, ASO

Białka dodatkowo oznaczane nefelometrycznie: Podklasy IgG 1-4 i IgA 1-2, składowe, czynniki i białka regulatorowe dopełniacza, hormony

Metody wykorzystujące znaczniki • Homogenne - reakcja zachodzi w roztworze • Heterogenne - przeciwciało jest związane z fazą stałą • Niekompetycyjne - bezpośrednie • Kompetycyjne - rywalizacyjne

Metody wykorzystujące znaczniki 1. Metody radioimmunologiczne (RIA) 2. Metody immunoenzymatyczne (ELISA)

Metody radioimmunologiczne Pomiar radioaktywności substancji znakowanych izotopem promieniotwórczym. Najczęściej stosowane izotopy: 125 I , 131I – emitery γ - do znakowania antygenów białkowych 14 C ,3 H – emitery β - do znakowania związków drobnocząsteczkowych

Metody radioimmunologiczne 1. Test bezpośredni w fazie płynnej (Farra) 2. Test pośredni w fazie stałej, 3. Test podwójnego wiązania w fazie stałej (test „kanapkowy”, sandwich test), IRMA 4. Test kompetycyjny w fazie stałej, RIA

Izotopowy test pośredni w fazie stałej antygen

przeciwciało I°

przeciwciało II° znakowane izotopem

Izotopowy test podwójnego wiązania w fazie stałej (IRMA – Immuno-Radio-Metric Assay) przeciwciało detekcyjne znakowane izotopem

antygen

przeciwciało separujące

radioaktywność

Izotopowy test podwójnego wiązania w fazie stałej (IRMA – Immuno-Radio-Metric Assay)

Ilość związanego antygenu

Test kompetycyjny w fazie stałej (RIA – Radio-Immuno-Assay)

antygen badany antygen znakowany izotopem

radioaktywność

Test kompetycyjny w fazie stałej (RIA – Radio-Immuno-Assay)

Ilość związanego antygenu

Metody radioimmunologiczne Zalety: – wysoka czułość

Wady: – praca z materiałem radioaktywnym, – niebezpieczne odpady, – niezbędna aparatura

Metody radioimmunologiczne - zastosowanie Oznaczanie stężenia: hormonów, antygenów nowotworowych (np. CEA, AFP), autoprzeciwciał, swoistych przeciwciał klasy IgE (np. RAST, RIST), a także innych związków np. leków, witamin.

Metody immunoenzymatyczne Wykorzystanie katalitycznych właściwości enzymów w wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu substancji w reakcjach immunologicznych. Najczęściej stosowane enzymy: – – – – – –

Fosfataza alkaliczna Peroksydaza chrzanowa β-Galaktozydaza Oksydaza glukozowa Ureaza Katalaza

Metody immunoenzymatyczne – typy reakcji

bezpośredni

pośredni

kanapkowy

kanapkowy z podwójnym przeciwciałem detekcyjnym

kompetycyjny

Koniugaty i substraty znakowane enzymem przeciwciała lub antygeny detekcyjne

Enzym Fosfataza alkaliczna

Związek

Odczyt (filtr, λ)

p-nitrofenylofosforan sodowy

410 nm

o-fenylenodiamina (OFD) + H2O2

495 nm

Peroksydaza chrzanowa Tetrametylobenzydyna (TMB)

650 nm bez przerywania reakcji 450 nm z H2SO4

Krzywa kalibracyjna zależność liniowa

plateau

absorbancja

tło

stężenie badanego składnika

Testy ELISA w diagnostyce medycznej

- Oznaczanie antygenów (kompletnych) - Oznaczanie specyficznych przeciwciał - Testy kompetytywne – oznaczanie haptenów (antygenów niekompletnych)

Wykrywanie antygenów • zastosowanie swoistych przeciwciał, • poliklonalność przeciwciał zwiększa swoistość testu, można użyć przeciwciał od dwóch różnych gatunków zwierząt, • częściej stosuje się przeciwciała monoklonalne, także dwa różne. Oznaczenie stężeń: – – – – – –

hormonów białkowych markerów towarzyszących nowotworom białek ostrej fazy cytokin, cząsteczek adhezyjnych, niektórych patogenów

Wykrywanie swoistych przeciwciał •

•

•

•

Faza stała opłaszczona antygenem izolowanym zdanego czynnika patogennego – białka silnie immunogenne wywołujące szybką odpowiedź zainfekowanego organizmu; antygeny rekombinowane zwiększają specyficzność testu; zastosowanie mieszaniny przeciwciał Badana surowica, z poszukiwanymi przeciwciałami. Jeżeli badany miał kontakt z patogenem, przeciwciała są obecne i zwiążą się z antygenami na płytce. Koniugat - przeciwciało przeciwko ludzkim immunoglobulinom (albo konkretnej ich klasie), znakowane enzymem. Wiąże się do badanych przeciwciał, obecnych w kompleksach na płytce. Chromogen lub substrat reakcji enzymatycznej, który enzym przekształca w barwny produkt reakcji.

Zastosowanie: – diagnostyka chorób zakaźnych – identyfikacja alergenów – diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych

Wykrywanie haptenów Testy kompetycyjne (konkurencyjne)

Oznaczenie stężeń: – hormonów steroidowych i tarczycy – pozostałości i metabolitów leków – używek i suplementów (narkotyki, anaboliki)

ELISA Zalety: wysoka czułość i swoistość Wady: – koszt, – czas oznaczenia, – skomplikowana procedura

Czynniki określające wiarygodność metody – – – –

swoistość czułość dokładność precyzja